Charakterisierung der Regulation der gerichteten Migration und Invasion humaner Pankreaskarzinomzellen durch den neuronalen Wachstumsfaktor GDNF

Abstract

Die starke Infiltration intra- und extrapankreatischer peripherer Nerven gilt als Hauptursache für das Auftreten lokaler Rezidive und die äußerst schlechte Prognose von exokrinen Pankreaskarzinomen. Die hohe Affinität der Tumorzellen zu peripherem Nervengewebe und die bereits in frühen Tumorstadien einsetzende perineurale Invasion machen eine spezifische Interaktion zwischen den Pankreaskarzinomzellen und den peripheren Nerven wahrscheinlich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher nach Signalmolekülen gesucht, die an der Induktion der perineuralen Invasion humaner Pankreaskarzinomzelllinien beteiligt sein könnten. Der Einfluss konditionierter Medien neuronaler und glialer Zellen sowie spezifischer rekombinanter neuronaler Faktoren auf die Proliferation und Chemotaxis humaner Pankreaskarzinomzelllinien wurde analysiert. Hierbei wurde der neurotrophe Faktor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) als Chemotaxis-induzierender Faktor für PANC-1-Zellen identifiziert. Da GDNF bei neuronalen Zellen seine spezifische Wirkung durch Bindung an den GDNF-Rezeptor-Komplex entfaltet, wurde die Expression dieses Rezeptor-Komplexes, bestehend aus der Rezeptortyrosinkinase Ret und dem GPI-Anker-Protein GFRa, in PANC-1-Zellen nachgewiesen. Mittels RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion)- und Western blot-Analysen konnte die Expression der beiden GDNF-Rezeptor-Komponenten Ret und GFRa1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene demonstriert werden. Eine nähere Charakterisierung des GDNF-Rezeptor-Komplexes in PANC-1-Zellen durch RT-PCR-Analysen ergab, dass die Transkripte von zwei GFRa-Proteinen, GFRa1 und GFRa2, und den drei bekannten Ret-Isoformen, Ret9, Ret43, Ret51, in PANC-1-Zellen nachweisbar sind. Durch Sequenzanalyse des Ret51-Transkriptes aus PANC-1-Zellen konnte die Expression der wildtypischen Sequenz in diesen Zellen bestätigt werden. Nachfolgend wurde die vollständige kodierende Ret51-DNA-Sequenz in den pEGFP-N1-Vektor kloniert und die Expression der Ret-EGFP-Fusionsproteine in PANC-1- und HEK293-Zellen in Fluoreszenz- und Western blot-Analysen überprüft. Zur Untersuchung Ret-abhängiger Signaltransduktionswege in PANC-1-Zellen wurden Ras- und Rac-GTP-Präzipitationsversuche und Kinaseaktivitätsanalysen der MAP-Kinasen ERK2 und JNK anhand von in vitro Phosphorylierungsexperimenten durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit GDNF zu einer Steigerung der N-Ras- und Rac-GTP-Menge in PANC-1-Zellen führt und die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK induziert. Durch Migrationsexperimente in Anwesenheit des MEK1-Inhibitors PD98059 und des PI3-Kinase-Inhibitors LY294002 konnte die Relevanz der Ras- Raf-MEK-ERK-Kaskade und der PI3-Kinase für die gerichtete Migration von PANC-1-Zellen herausgestellt werden. Um den Einfluss verschiedener Rho-Proteine auf Migrations- und Invasionsprozesse humaner Pankreaskarzinomzelllinien analysieren zu können, wurde die RhoC-cDNA-Sequenz aus BxPC-3-Zellen amplifiziert und PANC-1-Zellklone generiert, welche EGFP-RhoC- oder EGFP-RhoA-Fusionsproteine stabil überexprimieren. Das Migrationsverhalten dieser Zellklone wurde im Boyden-Kammer-System analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass die Expression von EGFP-RhoC im Gegensatz zu EGFP-RhoA zu einer deutlichen Steigerung der Chemotaxis bei PANC-Zellen führt. Somit wurden entscheidende molekulare Mechanismen aufgedeckt, die für die GDNF-induzierte Migration von PANC-1-Zellen relevant sind. Es wäre darüber hinaus möglich, dass das GDNF/Ret/GFRa-System sowie die kleine GTPase RhoC an der perineuralen Invasion von Pankreaskarzinomzellen in vivo beteiligt sind.

Infiltration of intra- and extrapancreatic perineural spaces and tissues is characteristic for pancreatic adenocarcinoma and is related to the poor prognosis of this disease. The high affinity of the pancreatic cancer cells to neural tissues, even at very early tumour stages, indicates a particular attraction probably mediated by specific factors. The aim of this work was to identify and characterise neuronal factors which can induce directed cell migration and perineural invasion of human pancreatic cancer cells and to analyse the underlying signal transduction pathways. For this, the influence of conditioned media of various glial and neuronal cells as well as specific recombinant neurotrophic factors on proliferation and migration of human pancreatic carcinoma cell lines was analysed. As a result, the neurotrophic factor GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) was identified as an effective chemoattractant for PANC-1 cell line. In the neuronal system, GDNF exerts its specific effects by binding to the heterodimeric GDNF-receptor complex, consisting of the receptor tyrosine kinase Ret and the GPI-anchored protein GFRa. To determine the expression of the GDNF-receptor complex in PANC-1 cells, RT-PCR and Western blot analyses were performed. By this, the GDNF-receptor components, Ret and GFRa, were detected on both, mRNA and protein level. Furthermore, characterisation of the GDNF-receptor by RT-PCR could demonstrate the presence of the transcripts of two GFRa-proteins, GFRa1 and GFRa2, and of the three known Ret-isoforms Ret9, Ret43 and Ret51. Beyond this, sequence analysis of the Ret51-transcript expressed in PANC-1 cells revealed the expression of Ret-wildtype sequence. The complete coding Ret51-cDNA-sequence was cloned into the pEGFP-N1 vector and the expression of the Ret-EGFP-protein was characterised by fluorescence and Western blot analyses. To investigate Ret-dependent signal transduction pathways in PANC-1 cells, Ras- and Rac-GTP-binding assays as well as analyses of kinase activity of the MAP-kinases ERK2 and JNK by in vitro phosphorylation assays were performed. By this, it was shown, that GDNF significantly increases the intracellular amounts of N-Ras- and Rac-GTP and induces phosphorylation of ERK2 and JNK, respectively. Migration assays in the presence of MEK1-inhibitor PD98059 and PI3-kinase-inhibitor LY294002 underlined the relevance of the Ras-Raf-MEK-ERK-signal transduction pathway and PI3-kinase in GDNF-induced directed cell migration. To investigate the influence of different Rho isoforms on the motility of pancreatic cancer cells, the coding rhoC-DNA-sequence was isolated from the pancreatic cancer cell line BxPC-3 and cloned into various expression-vectors. Then, PANC-1 cells were generated, which stably express EGFP-RhoA and EGFP-RhoC fusion proteins. Boyden chamber assays revealed, that only EGFP-RhoC increases the serum-induced directed cell migration of these stably transfected cell clones. So, in the present work, critical steps involved in GDNF-induced chemotaxis of pancreatic cancer cells were elucidated on the molecular level. Beyond this, the GDNF/Ret/GFRa signal transduction system as well as the small GTPase RhoC could be involved in perineural invasion of pancreatic cancer cells in vivo.