Identifizierung und vergleichende Charakterisierung eines zentralen Regulationsfaktors der Morphogenese und des Stickstoffmetabolismus in humanpathogenen Pilzen

Abstract

Von den etwa 200 verschiedenen Pilzen der Hefegattung Candida gilt insbesondere Candida albicans als der medizinisch bedeutendste Hefepilz, da er als fakultativ pathogener Erreger zwar bei 75% der Bevölkerung hauptsächlich den Gastrointestinaltrakt symptomlos besiedelt, jedoch bei immunsupprimierten Patienten über zwei Drittel aller invasiven, systemischen Infektionen auslöst, die eine Mortalitätsrate von über 30% aufweisen. Mit der Identifizierung von Candida dubliniensis wurde ein sehr naher Verwandter von C. albicans beschrieben, der trotz einer sehr engen phylogenetischen Verwandtschaft und ähnlichen phänotypischen Eigenschaften, in epidemiologischen Studien eine nur sehr geringe Prävalenz sowie eine deutlich reduzierte Virulenz aufweist. Ein Vergleich beider Candida-Spezies sollte daher die Grundlage bieten, Unterschiede zwischen den beiden Hefepilzen zu identifizieren, die zur verbesserten Adaptation von C. albicans gegenüber C. dubliniensis an den Wirtsorganismus führen und zu ihrer unterschiedlichen Pathogenität beitragen.

Durch eine vergleichende Analyse der beiden Candida-Arten insbesondere im Hinblick auf ihre unterschiedliche Induktion und Regulation von morphologischen Differenzierungsprozessen (z. B. der Transition von der sphärischen Blastopore zur filamentösen Wachstumsform, die in C. albicans als ein wichtige Virulenzfaktor angesehen wird) wurde in dieser Arbeit ein zentraler Morphogeneseregulator in C. dubliniensis identifiziert, der signifikante Homologien zu einer konservierten Klasse von Transkriptionsfaktoren in Pilzen aufweist, die als APSES-Proteine bezeichnet werden. Die Deletion dieses Gens und nachfolgende funktionelle Charakterisierung konnte zeigen, dass die Deletionsstämme neben einer veränderten Morphologie sich in der Induktion des hyphalen Wachstums und der Chlamydosporen-Ausbildung vom Wildtypstamm deutlich unterschieden. Aufgrund dieser Funktion als zentraler Morphogeneseregulator wurde das entsprechende Protein als Mom1 - „Modulator of Morphogenesis 1“ bezeichnet. Weiterführende Analysen konnten zeigen, dass MOM1 außerdem einen großen Einfluss auf das Adhäsions- und Invasionsverhalten sowie den Zellwandaufbau der Zellen hat. Diese Eigenschaften sind vergleichbar mit der Funktion des Efg1p in C. albicans. Durch die ektopische Expression von MOM1 im efg1Δ-Deletionsstamm oder die heterologe Integration von EFG1 in den mom1Δ-Deletionsstamm konnte der morphologische Phänotyp sowie die Defekte in der Zellwandzusammensetzung funktionell komplementiert werden. Durch differenzielle Genexpressionsstudien von Wildtyp- und Deletionsstämmen unter zwei unterschiedlichen Wachstumsbedingungen mithilfe der ebenfalls in dieser Arbeit etablierten und validierten MESSAGE-Technologie, die auf einer hochauflösenden zweidimensionalen Auftrennung der ds-cDNA-Fragmente basiert, konnte außerdem gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Mom1p - ähnlich wie Efg1p aus C. albicans- neben den Proteinen der Zellwand oder Zellmembran auch zahlreiche metabolische Prozesse reguliert. Je nach Bedingung wurden durch Deletionen von MOM1 zahlreiche Gene z. B. der Ribosomenbiogenese oder des Kohlenhydrat-metabolismus differentiell exprimiert. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal auch eine konservierte Funktion der APSES-Proteine Mom1p und Efg1p im Stickstoffmetabolismus beschrieben werden. Beide Proteine scheinen dabei eine essentielle Rolle als Schalterproteine spielen, ob nieder- oder hochmolekulare Stickstoffquellen für den Wachstumsprozess verwertet werden.

Trotz der konservierten Funktion zeigten sich zwischen beiden Candida-Arten signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation dieser APSES-Gene. So wurden MOM1 und EFG1 in den entsprechenden Wildtyp-Stämmen unter zahlreichen Bedingungen und unabhängig von der Zellmorphologie entgegengesetzt exprimiert. Durch den Austausch der gesamten MOM1-Promotorregion durch den EFG1-Promotor konnte jedoch Art und Verlauf der C. albicans EFG1-Induktion auch in C. dubliniensis beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die antagonistische Genexpression hauptsächlich auf verschiedene cis-regulatorische Elemente in den jeweiligen Promotorsequenzen von MOM1 und EFG1 zurückgeführt werden können. Interessanterweise konnten wir trotz der gleichen C. albicans-spezifischen Regulation des heterolog exprimierten EFG1 mit Promotor im ∆mom1-Deletionshintergrund keine Induktion des hyphalen Wachstums in C. dubliniensis beobachtet werden. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass die morphologische Transition in C. albicans durch einen weiteren regulatorscher Signalweg induziert wid, der in C. dubliniensis entweder nicht vorhanden oder aktiviert ist.

Diese Aktivierung von verschiedenen Signaltransduktionswegen oder die differentielle Regulation von Genen können somit die Gründe dafür sein, weshalb so phylogenetisch nahe verwandte Arten sich in der Expression von Virulenzfaktoren und ihrer Pathogenität unterscheiden.

Among the 200 different known yeast species of the genus Candida, Candida albicans is considered to be the most important clinical fungus which colonizes as a facultative pathogen the gastrointestinal tract of 75% of the healthy population but causes over two thirds of all invasive, systemic infections in immunocompromised patients with a mortality rate over 30%. With the identification of Candida dubliniensis, a very close relative of C. albicans has been characterized, which in spite of a very close phylogenetical relationship and similar phenotypic traits exhibits only a lower prevalence and reduced virulence in epidemiological studies. Therefore, a comparison of both Candida species should allow the identification of species-specific differences of the two yeast species, which are responsible for a better adaptation of C. albicans to the host compared to C. dubliniensis and also to their different pathogenicity.

Using a comparative analysis of both Candida species especially with regard to their different induction and regulation of morphogenetic processes (e.g. the transition of the spherical blastospore to the filamentous growth form, which is considered to be an important virulence factor of C. albicans) this work focuses on the identification of a central morphogenetic regulator in C. dubliniensis, which shows significant homologies to a conserved class of transcription factors in fungi, being described as APSES proteins. The deletion of this gene and subsequent functional characterization could show that deletion strains express an altered morphology as well as a considerable different kind of induction of hyphal growth and chlamydospore development if compared with a wild type strain. Due to this function as a central regulator of morphogenesis the corresponding protein was termed Mom1p -“Modulator of Morphogenesis 1”. Further analyses could indicate that Mom1p has a significant impact on adhesion and invasion as well on the cell wall assembly. These characteristics are comparable with the function of Efg1p in C. albicans. The ectopic expression of MOM1 in a efg1∆-deletion strain or the heterologous integration of EFG1 in the mom1∆-deletions strain could functionally complement the morphological phenotype as well as the defects in cell wall composition. Applying differential gene expression profiling of the wildtype and the deletion strain under two different growing conditions using the MESSAGE-technology, which was also established and validated within the scope of this work and that is based on a high resolution, two-dimensional separation of ds-cDNA-fragments, we could also show, that the transcription factor Mom1p - alike Efg1p of C. albicans - regulates proteins of the cell wall or cell membrane in addition to numerous metabolic processes. Depending on the growth condition, various genes e. g. for ribosome biosynthesis or carbon metabolism were differentially expressed, when MOM1 was deleted. Within the scope of this work we could also describe for the first time a conserved function of the APSES proteins Mom1p and Efg1p in the nitrogen metabolism. Both proteins seem to have an essential function in the decision whether low– or high molecular nitrogen sources should be utilized for growth of the cell.

Despite of a conserved function, APSES proteins of both Candida-species revealed significant differences in their own transcriptional regulation. Thus, under various conditions MOM1 and EFG1 of the corresponding wildtype strain show an opposite expression pattern in a morphology-independent manner. However, the type and course of the C. albicans EFG1 induction could also be restored in C. dubliniensis when the MOM1-promotor was replaced by the EFG1-promotor. These results indicate that the antagonistic gene expression could be mainly due to different cis-regulatory elements in the corresponding promotor sequence of MOM1 and EFG1. Interestingly, although the heterologous expression of EFG1 in the mom1∆-deletion background could regulate the expression of EFG1 in a C. albicans-specific manner, we could not observe any hyphal induction in C. dubliniensis, indicating that morphological transition in C. albicans is induced by a different regulatory pathway, which is not present or not activated in C. dubliniensis.

In conclusion, activation of different pathways or different type of regulation of virulence genes might be on of the main reason, why so closely related species like C. albicans and C. dubliniensis might differ in their expression of virulence factors and their pathogenicity.