Biomarker discovery and pathway activation profiling in breast cancer using protein microarrays

Abstract

Breast cancer, the most frequent cancer entity among women, is nowadays widely recognized as a heterogeneous disease in terms of histopathology as well as on the molecular level. Over the last few years, gene expression profiling studies have improved our understanding of the underlying molecular mechanisms associated with the very heterogeneous outcomes of breast cancer patients. The existence of intrinsic molecular subtypes, which are linked to unique biological and prognostic features, was repeatedly demonstrated and points to the need of tailored therapy options. However on the functional level, breast cancer is not only a genomic but mainly a proteomic disease and gene expression profiling might provide only limited insights. Following the hypothesis that intrinsic biologic features of breast tumors affect prognosis and also therapy response, the general aim of this thesis was to further explore breast cancer heterogeneity with protein microarrays on the functional proteomics level. Around 70 – 80% of all breast cancer patients belong to the luminal intrinsic molecular subtype, characterized as a surrogate marker by overexpression of hormone receptors. An improved classification of this subtype is crucial for therapy decision as part of the patients are at higher risk of recurrence requiring chemo-endocrine treatment, whereas the other part is at lower risk and does not benefit from chemotherapy. However, accurate definition of low and high risk hormone receptor-positive breast cancer has remained a challenge so far. Thus, the first objective of this thesis was the identification of a robust and quantitative protein biomarker signature to facilitate risk classification of hormone receptor-positive breast cancer. To approach this aim reverse phase protein arrays were used to screen across over 120 breast cancer relevant proteins and a novel bioinformatics workflow for biomarker hit selection was applied. Using this approach, a biomarker signature consisting of caveolin-1, NDKA, RPS6, and Ki-67, was identified as most promising to distinguish between low and high risk hormone receptor-positive breast cancer. Since genomic and transcriptomic profiling alone cannot sufficiently predict protein pathway activation, it is important to explore and define the heterogeneity of hormone receptor-positive breast cancer on the proteome level. Especially as protein signaling pathways present the direct targets of new classes of therapeutics. Thus, the second thesis objective addressed the question of whether hormone receptor-positive breast cancer can be further categorized according to similar signaling pathway activation patterns and whether these patterns reflect common molecular mechanisms. Therefore, comprehensive protein pathway activation profiles of breast cancer specimens were obtained using reverse phase protein arrays. To complement this analysis, a microspot immunoassay was developed, which enabled the simultaneous quantification of eight different growth factors in tumor lysate as well as blood plasma of matching patient samples. Four subgroups were identified, based on differential expression of 90 cancer-relevant signaling proteins. Each subgroup showed unique characteristics which were also related to established clinicopathological features as well as growth factor expression. One subgroup, for example, was characterized by high expression levels of almost all analyzed proteins. In addition, VEGF tumor lysate levels were significantly higher in this subgroup and an enrichment of poorly differentiated tumors was observed underlining the aggressive phenotype. In contrast, another subgroup was characterized by weak signaling activity. Interestingly, this subgroup was mostly associated with invasive lobular carcinoma, the second most common histologic type of breast cancer, reflecting a link between histopathology and underlying molecular mechanisms. In summary, the reverse phase protein array based pathway activation profiling of hormone receptor-positive breast cancer, presented in this thesis, provides a comprehensive snapshot of the heterogeneity of this subtype on the proteomic level. Insights obtained can serve as basis to refine the concept of clinically relevant subtypes towards an improved definition of patient-tailored therapy options.

Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und wird mittlerweile als heterogene Erkrankung wahrgenommen. Diese Heterogenität spiegelt sich in der Histopathologie wie auch auf molekularer Ebene wieder. In den letzten Jahren haben vor allem Genexpressionsstudien zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die für die unterschiedlichen Krankheitsverläufe der Patientinnen verantwortlich sind, beigetragen. Die Existenz von intrinsischen molekularen Subtypen konnte wiederholt bestätigt werden. Die unterschiedlichen biologischen und prognostische Eigenschaften dieser molekularen Subtypen deuten auf die Notwendigkeit von maßgeschneiderten Therapien hin. Jedoch ist Brustkrebs auf funktionaler Ebene vor allem eine proteomische Erkrankung. Genexpressionsstudien können daher wahrscheinlich nur limitierte Einblicke bieten. Basierend auf der Hypothese, dass intrinsische biologische Eigenschaften der Tumore die Prognose sowie das Therapieansprechen beeinflussen, war das allgemeine Ziel dieser Dissertation, die Heterogenität von Brustkrebs auf funktionaler Proteome Ebene mittels Protein-Microarrays, besser zu verstehen. Die Merheit aller Brustkrebs Patientinnen wird mit einem Tumor des luminalen Subtyps diagnostiziert, welcher hauptsächlich durch eine Überexpression von Hormonrezeptoren charakerisiert ist. Eine weitere Klassifizierung dieses Subtyps ist äußerst wichtig, um die Therapieentscheidung zu unterstützen. Bei Patientinnen mit einem hohen Rückfallrisiko ist zusätzlich zu einer antihormonellen Behandlung eine Chemotherapie indiziert, wohingegen Patientinnen mit einem niedrigen Rückfallriskio nicht von einer Chemotherapie profitieren. Jedoch stellt die präzise Unterscheidung zwischen niedrigem und hohem Rückfallrisiko zur Zeit noch eine Herausforderung dar. Der Fokus dieser Dissertation lag daher zunächst auf der Identifizierung einer robusten und quantitativen Biomarker Signatur, die zur verbesserten Risikoklassifizierung bei Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs beitragen kann. Reverse Phase Protein-Arrays wurden verwendet, um in Kombination mit einem neu entwickelten Biomarker-Identifikationsprozess die optimale Biomarker Signatur aus über 120 brustkrebsrelevanten Proteinen zu bestimmen. Mit diesem Vorgehen konnte eine Biomarker Signatur, bestehend aus Caveolin-1, RPS6, NDKA und Ki-67, als am vielversprechendsten identifiziert werden, um zwischen einem niedrigen und hohen Rückfallrisiko zu unterscheiden. Der zweite Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Fragestellung, ob Hormonrezeptor-positiver Brustkrebs anhand von ähnlichen Signaltransduktionsaktivitätsmustern weiter stratifiziert werden kann und ob diese Aktivitätsmuster gemeinsame molekulare Mechanismen wiederspiegeln. Es wurden umfassende Proteinaktivitätsprofile von Tumoren mittels Reverse Phase Protein-Arrays erstellt. Um die Analyse zu erweitern, wurde zusätzlich ein Microspot-Immunoassay entwickelt, welcher die parallele Quantifizierung von acht unterschiedlichen Wachstumsfaktoren in Tumor- und Blutplasmaproben ermöglichte. Anhand der Analyse von 90 verschiedenen krebsrelevanten Signalproteinen konnten vier unterschiedliche Gruppen identifiziert werden. Jede Gruppe zeigte charakteristische Signaltransduktionsaktivitätsmuster. Desweiteren konnten diese vier Gruppen mit etablierten pathologischen Faktoren sowie mit der Expression von Wachstumsfaktoren in Verbindung gebracht werden. Eine Gruppe zeigte zum Beispiel eine stark erhöhte Signalaktivität bei einer Vielzahl der analysierten Proteine. In dieser Gruppe konnte zusätzlich eine signifikant erhöhte VEGF Konzentration sowie eine Anreicherung von schlecht differenzierten Tumoren beobachtet werden, wodurch der aggressive Phänotyp noch weiter bestärkt wurde. Im Gegensatz dazu, zeigte eine andere Gruppe eher schwache Signalaktivität für eine Vielzahl der analysierten Proteine. Interessanterweise wurde in dieser Gruppe ein hoher Anteil an Tumoren vom Typ des invasiven lobulären Karzinoms beobachet. Diese Beobachtung macht die Verbindung von histophatologischen und molekularen Eigenschaften deutlich. Die durchgeführte Analyse der Signaltransduktions-aktivitätsmuster bei Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs zeigt die Heterogenität dieses Subtyps auf Proteome Ebene. Die neu gewonnenen Einblicke können als Grundlage für die Verbesserung der Definition von klinisch relevanten Subtypen dienen und zur Entwicklung von personalisierten Therapieansätzen beitragen.