Far-infrared spectroscopy on proteins : bringing together experiments, simulations, and theory

Abstract

This thesis is focused on experiments, simulations as well as theoretical issues related to the far-infrared properties of proteins. The main developed setup is an atmosphere cell which allows temperature and hydration dependent measurements of proteins in the far-infrared from about 40 cm-1 to about 690 cm-1. The comparison between the four measured proteins Beta-Lactoglobulin from bovine milk, Bovine Serum Albumin, Hen Egg White Lysozyme, and Trypsin Inhibitor from hen egg white, revealed protein specific as well as presumably unspecific absorption bands within far-infrared frequency range. The absorption peaks of these proteins have been identified. With our atmosphere cell we are able to probe directly the influence of the attached water molecules on the far-infrared spectra of the protein-water system by varying the external humidity and hence solely the amount of water molecules. Our hydration dependent measurements revealed a small impact of this parameter on the protein far-infrared absorption, so that we were able to deduce that biological water at least absorbs one order of magnitude less than liquid water in the far-infrared frequency range. These results support the “iceberg”-model for biological water molecules. The consequences of temperature variation on the measured protein spectra as the second independently changeable parameter within the atmosphere cell, can be split into three different effects. Underneath the major frequency independent absorption decrease, two frequency dependent temperature effects have been identified. Since there have been no models present to explain the large broadband absorption decrease upon a rise of temperature, we developed our own Model of Energy Related Correlation Effects in Proteins (MERCEP) which we substantiated by accompanying molecular dynamics simulations probing certain aspects of this model. We claim that temperature elevation causes a correlation decrease within the protein, reducing absorption strength relevant, predominately induced, dipole momenta as well as infrared active (collective) motions to be observed in this particular frequency region. Other topics of this thesis concern the calculation of far-infrared spectra from MD-Simulations, the refutation of a boson peak in proteins and the Sorption-Isotherm-Equation for external hydration. Also a review of far-infrared spectroscopy on proteins and reviews of the adjacent frequency ranges are included.

Diese Doktorarbeit befasst sich mit Experimenten, Simulationen und theoretischen Fragestellungen zur Ferninfrarotspektroskopie an Proteinen. In diesem Frequenzbereich werden für die Funktionalität von Proteinen wichtige kollektive Bewegungen erwartet. Trotzdem fehlten bisher reproduzierbare Ferninfrarotspektren unter definierten Bedingungen, sowie Messungen zur Abhängigkeit bzgl. der wichtigen Parameter Temperatur und Hydrierung. Für den experimentellen Teil, dem Schwerpunkt dieser Arbeit, wurden insgesamt fünf Messaufbauten konzipiert, die es erlauben Proteine unter einen Infrarotmikroskop zu messen, welches als Quelle ein Fourier-Transform-Spektrometer nutzt. Mit dem wesentlichen Aufbau, der sogenannten „Atmosphärenzelle“, sind Messungen im Frequenzbereich von ca. 40 cm-1 bis 690 cm-1 möglich, was ungefähr 1 bis 20 THz entspricht. Damit reicht der Messbereich über den Ferninfrarot- in den Terahertz-Frequenzbereich hinein. Der Messaufbau erlaubt es außerdem die beiden wichtigen Parameter Temperatur und Hydrierung zu variieren. Diese beeinflussen die Proteindynamik, so dass Auswirkungen auf das Ferninfrarotspektrum von Proteinen zu erwarten sind, was sich auch in den Messergebnissen bestätigte. Um temperatur- und feuchtigkeitsabhängige Messungen zu realisieren wurde eine eigene Präparationsmethode entwickelt, die es erlaubt freitragende Proteinfilme herzustellen. Gemessen wurden vier Proteine Bovine Serum Albumin (BSA), Hen Egg White Lysozyme (HEWL), Beta-Lactoglobulin und Trypsin Inhibitor. In der Analyse wurden Hinweise darauf gefunden, dass im Ferninfrarot sowohl allgemeine als auch proteinspezifische Absorptionsbanden auftreten, die Proteine sich also anhand ihrer Spektren unterscheiden lassen. Eine Variation der externen Hydrierung der Proteine hat nur einen geringen Effekt auf das Ferninfrarotspektrum der Proteine und zeigt nur eine kleine, aber reproduzierbare frequenzunabhängige Zunahme der Absorption mit steigender Hydrierung. Aus einem quantitativen Vergleich konnte geschlossen werden, dass biologische Wassermoleküle in der Umgebung des Proteins eine deutlich geringere Ferninfrarot-absorption zeigen als flüssiges Wasser. Temperaturänderungen hingegen haben einen deutlich größeren Einfluss auf die Ferninfrarot-spektren als eine Änderung der Hydrierung. Temperaturänderungen haben einen starken Einfluss auf die Ferninfrarotspektren der Proteine. Der frequenzunabhängige Temperatureffekt zeigt einen deutlichen Absorptionsrückgang mit steigender Temperatur für alle Proteine. Mögliche Erklärungen hierfür haben wir in unserem Model of Energy Related Correlation Effects in Proteins (MERCEP) zusammengefasst, welches zur Klärung spezifischer Fragestellungen mit molekulardynamischen Simulationen untermauert wurde. Wir glauben, dass die steigende Temperatur Korrelationen innerhalb des Proteins reduziert, welche die für die Infrarotabsorption relevanten Dipolmomente sowie kollektive Bewegungen betrifft. Daneben ist in dieser Arbeit ein Review über die bisher publizierten Ferninfrarotspektren von Proteinen enthalten, sowie Reviews über relevante Messungen im Terahertz- und mittleren Infrarotfrequenzbereich. Außerdem wurden die Ergebnisse der Messungen und Simulationen in eine umfangreiche Betrachtung verschiedener theoretischer Themen eingebettet, die im Kontext dieser Arbeit behandelt wurden. So haben wir beispielsweise den in der Literatur bestehenden Dissens bzgl. der Existenz eines Bosonpeaks in Proteinspektren aufgegriffen. Proteine zeigen zwar eine breite Absorptionsbande in einem ähnlichen Frequenzbereich wie der Bosonpeak in Gläsern, jedoch sprechen die Temperatur- und Feuchtigkeitsabhängigkeit, sowie die Existenz bei Temperaturen oberhalb des dynamischen Übergangs gegen die gleiche physikalische Ursache dieser Absorptionsbande. Der dynamische Übergang in Proteinen wird gerne auch als Glasübergang bezeichnet, jedoch zeigt der Verlauf der Wärmekapazität einen eindeutig anderen Verlauf als bei Gläsern, so dass auch dieser Begriff für Proteine nicht verwandt werden sollte. Außerdem ist in dieser Arbeit ein Weg beschrieben Ferninfrarot-spektren von Proteinen auf Basis von molekulardynamischen Simulationen zu berechnen. Dazu wurde auf Kubos quantenmechanische Formulierung des Dissipation-Fluktuation-Theorems und die Dipolmoment-Korrelationsfunktion zurückgegriffen. Wir hoffen damit korrespondierenden Simulationen zu unseren hier präsentierten Ferninfrarotmessungen an Proteinen den Weg zu bereiten.