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Autor(en): Appel, Daniel
Titel: Biotransformation von 11-Desoxycortisol mit Schizosaccharomyces pombe und Aspergillus nidulans
Sonstige Titel: Biotransformation of 11-Desoxycortisol using Schizosacchormyces pombe and Aspergillus nidulans
Erscheinungsdatum: 2005
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-25224
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/820
http://dx.doi.org/10.18419/opus-803
Zusammenfassung: In diesem Projekt, welches in Kooperation mit dem Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes und der Schering AG Bergkamen durchgeführt wurde, sollte mit Hilfe von rekombinanten Spalthefestämmen, welche die humane Monooxygenase P450 CYP11B1 exprimieren, eine nachhaltigere Bio-Produktion von Hydrocortison entwickelt werden, um das bestehende Verfahren der Hydrocortisonherstellung, mittels des filamentösen Pilz Curvularia lunata zu ersetzen. Um die Optimierung der Hydrocortisonproduktion im Fermenter zu verfolgen, wurde zunächst ein alternatives Nachweissystem für Hydrocortison entwickelt, welches eine schnellere semi-quantitative Bestimmung der Hydrocortisonmenge im Fermenter erlaubt. Der im ersten Teil dieser Arbeit entwickelte Assay basiert auf der Bildung eines Fluorophors bei Inkubation von Hydrocortison mit einer konzentrierten Schwefelsäure/Essigsäure-Mischung. Der so entwickelte Assay erlaubt eine direkte semi-quantitative Bestimmung des Hydrocortisons und dient dazu, die Veränderungen der Hydrocortison-Bildungsraten während der Fermentation zu Überwachen. Für die Bestimmung der exakten Hydrocortison-Mengen wurde eine bereits beschriebene HPLC-Methode verwendet. Die Optimierung der Fermentation wurde hauptsächlich mit den beiden rekombinanten S. pombe Stämmen CAD1 und CAD13 durchgeführt, welche die humane CYP11B1 Monooxygenase mitochondrial exprimieren. Beide Stämme wurden am Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes entwickelt. Die ersten rekombinanten Stämme zeigten Umsatzraten von nur 3,1 μM*d-1. Diese Rate konnte für den CAD1-Stamm durch Fermentationsoptimierung auf 70,6 μM*d-1 erhöht werden. Durch Einbringen einer zusätzlichen Kopie des CYP11B1 auf einem autoso-mal replizierenden TOPO-Plasmid (CAD13-Stamm) ließ sich die Expressionsrate des P450 CYP11B1 und somit auch die Umsatzrate von Hydrocortison auf 168 µM*d-1 steigern. Durch die Optimierung der Fermentationsbedingungen bezüglich Umsatzrate und Biomasseproduktion wurde ein Fed-Batch-Prozess entwickelt, welcher eine gesteigerte Raum-Zeit-Ausbeute ermöglichte. Der im ersten Teil entwickelte Hydrocortison-Assay wurde zum Screening eingesetzt, um Stämme zu finden, welche in der Lage sind, eine Hydroxylierung von 11-Desoxycortisol an Position 11 des Steroidgrundgerüsts durchzuführen. Trotz der eigentlich unspezifischen Reaktion des Hydrocortison-Assays bilden nur Steroide mit einer Hydroxyl-Gruppe an Position 11 einen fluoreszierenden Farbstoff aus. Beim Screening einiger am Institut für Technische Biochemie vorhandenen Stämme konnte bei dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans eine hohe 11-Hydroxylierungs-Aktivität bei Verwendung von 11-Desoxycortisol als Substrat festgestellt werden. Die HPLC/MS- und 1H-NMR-Analyse zeigte die Bildung von epi-Hydrocortison (11alpha-Hydroxylierung), eines pharmakologisch unwirksamen Epimeren von Hydrocortison (11beta-Hydroxylierung). Durch die hohe Regioselektivität der gefundenen Reaktion wurde in weiteren Experimenten Progesteron als Substrat verwendet, welches in Säugetieren durch Hydroxylierung in 11alpha-Hydroxyprogesteron überführt wird. Nach Analyse mit 1H-NMR konnte gezeigt werden, dass Progesteron durch Aspergillus nidulans regioselektiv in 11alpha-Hydroxyprogesteron überführt wird. Es konnte in dieser Arbeit ein Steigerung der Hydrocortison-Bildungsrate durch Optimierung von diversen Fermentationsparametern von 3,1 µM*d-1 auf 168 µM*d-1 erreicht werden. Eine weitere Optimierung der verwendeten Stämme ist unbedingt erforderlich, da eine Nebenproduktbildung, wie die eines dehydrogenierten 11-Desoxycortisol-Derivats durch S. pombe, bei der Herstellung pharmakologischer Wirkstoffe nicht tolerierbar ist. Durch das entwickelte alternative Nachweisverfahren von Hydrocortison konnte ein filamentöser Pilz gefunden werden, welcher eine hohe 11-Hydroxylierungs-Aktivität gegenüber 11-Desoxycortisol und Progesteron zeigt, und die gebildeten Produkte durch NMR identifiziert werden. Die vollständige Sequenzierung des Genoms von Aspergillus nidulans erlaubt, die für die gefundene Aktivität verantwortlichen P450-Isoenzyme zu identifizieren und in andere Hefestämme wie Pichia pastoris zu klonieren.
The main goal of this work, the development and establishment of an optimized fermentation method for the production of hydrocortisone using recombinant Shizosaccharomyces pombe strains was part of the BMBF project "Production of hydrocortisone using recombinant fission yeast strains". The first strain developed for fermentation optimization was the strain CAD1. This strain bears the human P450 CYP11B1 monooxygenase gene under the control of an nmt-promotor. The plasmid integrated in the genome of S. pombe by homologous recombination in the leu1-locus of chromosome 2 of the genome. Therefore the resulting recombinant strain was leucine auxotrophic towards. The second strain which was developed, CAD13, has an additional TOPO plasmid which bears the CYP11B1 gene under the control of nmt-promotor.In the first part of this work a new assay system for detection of cortisol was developed for monitoring the cortisol production rate when altering crucial growth parameters during fermentation. The detection of cortisol using HPLC is a precise but time consuming method for cortisol detection. Therefore a fast, semi-quantitative method was developed which is based upon the formation of a fluorimetric dye when incubating cortisol with a mixture of conc. sulfuric and acetic acid. The fermentation optimization was started using the S. pombe strain CAD1.A fed-batch strategy was found to show slow but continuous growth, forming only low amounts of metabolic byproducts like acetate or ethanol.The cortisol turnover rate was determined to 70.6 μM*d.Further optimization experiments where done using the recombinant S. pombe CAD13 strain. The production rate of cortisol increased to 144 μM*d when using 20 g/L glucose. In the last part of this work a screening for 11-hydyroxylase activity using the fluorescence assay developed in the first part was performed using randomly selected strain. Samples isolated from the biotransformation of Aspergillus nidulans, Pseudomonas citronellolis and Curvularia lunata showed strong fluorescence with the devloped Assay. Onyl Aspergillus nidulans was found to hydroxylate 11-Desoxycortisol yielding epiHydrocortisone.
Enthalten in den Sammlungen:03 Fakultät Chemie

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