Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.18419/opus-810
Authors: Toscano, Claudia
Title: Molecular analysis of mechanisms leading to CYP2D6 intermediate and ultrarapid metabolizer phenotypes
Other Titles: Molerkulargenetische Untersuchungen zu Mechanismen des CYP2D6 intermediären und ultraschnellen Metabolisierer-Phänotyps
Issue Date: 2006
Publication type: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-26092
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/827
http://dx.doi.org/10.18419/opus-810
Abstract: Genetic polymorphisms in drug metabolizing enzymes and transporters can considerably influence an individual's ability to metabolize and eliminate drugs and other xenobiotics. The consequences are unexpected reactions of patients to drug treatment. Depending on whether the polymorphism causes reduced or increased metabolism rate the consequences of a normal dosage can be adverse reactions or reduced efficacy. CYP2D6 is one of the most important drug metabolizing enzymes in human liver showing high interindividual variability with clinical relevance for drug treatment. Four distinct phenotypes are commonly observed in Caucasian populations, namely ultrarapid metabolizer (UM), extensive metabolizer (EM), intermediate metabolizer (IM) and poor metabolizer (PM) based on their drug oxidation capacity. The research of the last 25 years showed that interindividual differences are essentially caused by genetic polymorphisms at the CYP2D gene locus on chromosome 22. The numerous known allelic variants lead to increased, normal, decreased or absent 2D6 protein and/or function. Today, the presence of null mutations on both chromosomes allows the reliable identification of individuals with PM phenotype for adjustment of drug dosing. In contrast, ultrarapid and intermediate metabolizers, who may also be at increased risk, have a considerably poorer predictivity. The intermediate metabolizer phenotype comprises 10-15 % of a distinct population subgroup characterized by impaired but detectable residual enzyme activity. Two already known alleles, 2D6*9 and 2D6*10 were shown to be associated with lower in vivo metabolic capacity but they account for not more than 10-20 % of Caucasian IMs. In attempt to elucidate the genetic basis of the IM phenotype in the major fraction, the CYP2D6*41 allele was identified in our pharmacogenetic group at the IKP Stuttgart, which was found to be the second most frequent CYP2D6 deficient allele. The *41 allele is genetically closely related to the functionally *2 allele but lacks the -1584C>G mutation in the promoter region. Additionally, the 2988G>A polymorphism in intron 6 was found, but it remained unclear which of both mutations was causally responsible for impaired function of the *41 allele. Moreover it was unknown whether this were the only sequence differences or whether there were additional unidentified mutations present on the 2D6*41 allele. In this work it could be clearly demonstrated that the intron 6 polymorphism 2988G>A was causally responsible for markedly decreased expression of the gene product and its function in liver. An association between increased levels of a nonfunctional splice variant lacking exon 6 and the 2988G>A change was initially discovered by RT-PCR analysis of liver RNA of genotyped patients. Quantification by denaturing HPLC revealed up to 7.3-fold increased levels of the splice variant and up to 2.9-fold less functional transcript in carriers of 2D6*41, in good concordance with concomitant changes in immunoquantified CYP2D6 protein. The entire genomic sequence coding for 2D6*41, 2D6*2 and 2D6*1 alleles lacking the 5' upstream region was then recombinantly expressed in COS-1 (African green monkey kidney cell line) and human Huh7 hepatoma cell lines. The expressed 2D6*41 allele, differing from the *2 allele only by the presence of the intron 6 mutation, resulted in 2- to 5-fold reduced levels of CYP2D6 mRNA, apoprotein, and enzyme activity. These experiments established the causal relationship between the intron 6 SNP 2988G>A and the low expression phenotype associated with allele 2D6*41. To confirm the suspicion of an involvement in the splicing process further experiments to assess mRNA stability and reporter gene analyses in transiently transfected HepG2 and Huh7 hepatoma cells were performed. However no changes in mRNA turnover or transcription rate attributable to this polymorphism were observed. In silico analyses suggested that 2988G>A modifies binding sites for the splicing factors SRp40 and SF2/ASF. Further two individuals with an unexplainable phenotype were analyzed with a similar strategy. Both had genotype 2D6*2/*4 usually associated with normal function. Full genomic sequencing and haplotype analysis confirmed the previously identified silent mutation 2939G>A in exon 6 (former allele variant 2D6*2J, now termed 2D6*59), as well as an additional novel 2291G>A change in intron 4. Transient expression in Huh7 hepatoma cells with the respective genomic CYP2D6 sequence resulted in about three-fold reduced levels of mRNA, immunoreactive 2D6 protein and propafenone hydroxylase activity of constructs carrying either both or only the 2939G>A change. These data demonstrate profound effects of a silent mutation on expression and function of CYP2D6.
Genetische Polymorphismen in Arzneimittel metabolisierenden Enzymen und Transportern können die Fähigkeit, Arzneimittel und andere Fremdstoffe zu metabolisieren und auszuscheiden, erheblich beeinflussen. Die Folge sind unerwartete Reaktionen der Patienten auf die Arzneimitteltherapie. So können bei normaler Dosis Nebenwirkungen oder reduzierte Wirkung die Folge sein, je nachdem, ob die Metabolisierungsrate durch den Polymorphismus verlangsamt oder erhöht wird. CYP2D6 stellt eines der wichtigsten am Arzneimittelmetabolismus beteiligten Enzyme der menschlichen Leber dar, das in der Population eine erhebliche interindividuelle Variabilität zeigt, die für die Arzneimitteltherapie klinische Relevanz besitzt. Gemessen an der Arzneimittelstoffwechselkapazität lassen sich vier Phänotypen unterscheiden: ultraschnelle Metabolisierer (UM), normal effiziente Metabolisierer (EM), intermediäre Metabolisierer (IM) sowie langsame Metabolisierer (PM). Die Forschung der vergangenen 25 Jahre hat gezeigt, dass diese interindividuellen Unterschiede im Wesentlichen durch genetische Polymorphismen im CYP2D Genlokus auf Chromosom 22 verursacht werden. Zahlreiche allelische Varianten sind bekannt, die zu erhöhter, normaler, erniedrigter oder fehlender CYP2D6 Proteinmenge und/oder enzymatischer Funktion führen. Personen mit PM Phänotyp können heute anhand des Vorliegens von Nullmutationen auf beiden Chromosomen mit großer Zuverlässigkeit identifiziert und ggf. mit einer veränderten Dosis behandelt werden. Im Gegensatz dazu sind die ebenfalls mit einem Risiko behafteten ultraschnellen und intermediären Metabolisierer wesentlich schlechter vorhersagbar. Der intermediäre Metabolisierer-Phänotyp stellt eine Populationsubgruppe von 10-15 % dar und ist charakterisiert durch eingeschränkte aber noch nachweisbare Restenzymaktivität. Die beiden schon länger bekannten Allele 2D6*9 und 2D6*10 sind mit erniedrigter in vivo Metabolisierungskapazität assoziiert, dennoch ließen sich dadurch nicht mehr als 10-20 % der kaukasischen IMs erklären. Im Bestreben die genetische Basis für den IM Phänotyp aufzuklären wurde in der Arbeitsgruppe Pharmakogenetik am IKP Stuttgart das CYP2D6*41-Allel identifiziert, das sich als zweithäufigstes Defektallel des CYP2D6 Gens herausstellte. Genetisch ist das *41 Allel eng mit dem voll funktionsfähigen *2-Allel verwandt, von dem es sich vor allem durch das Fehlen einer -1584C>G Mutation im Promoter unterscheidet. Eine weitere Mutation 2988G>A war im Intron 6 von *41 gefunden worden. Es war jedoch nicht bekannt, welcher der beiden SNPs kausal für die erniedrigte Expression des Allels *41 verantwortlich war. Es war ebenfalls nicht zuverlässig bekannt, ob dies die einzigen Sequenzunterschiede waren oder ob möglicherweise eine weitere, noch nicht identifizierte Mutation auf dem *41 Allel existierte. In dieser Arbeit konnte nun zweifelsfrei gezeigt werden, dass der Intronpolymorphismus 2988G>A kausal für eine stark erniedrigte Expression des Genprodukts und damit seiner Funktion in der Leber verantwortlich ist. RT-PCR Analysen mit RNAs aus genotypisierten Leberproben zeigten zunächst, dass der 2988G>A Austausch mit einer Zunahme einer nichtfunktionellen Splice-Variante, der das Exon 6 fehlte, assoziiert war. Eine Quantifizierung mittels denaturierender HPLC offenbarte, dass Träger des 2D6*41 Allels bis zu 7,3-fach mehr Splice-Variante und 2,9-fach weniger Normal-Produkt aufwiesen, was in guter Übereinstimmung war mit der in denselben Leberproben gemessenen CYP2D6 Proteinexpression. Daraufhin wurde die gesamte genomische Sequenz, welche für die 2D6*41, 2D6*2 und 2D6*1 Allele kodiert, jedoch ohne Promotorregion, in COS-1 (Nierenzelllinie der afrikanischen grünen Meerkatze) und humanen Huh7 Hepatoma Zellen rekombinant exprimiert. Das 2D6*41-Allel, das die Intron 6 Mutation als einzigen Unterschied zum *2 Allel aufwies, exprimierte eine 2- bis 5-fach reduzierte Menge an CYP2D6 mRNA, Apoprotein und Enzymaktivität. Diese Experimente lieferten den unzweifelhaften Nachweis für einen kausalen Zusammenhang zwischen der Intron 6 Mutation 2988G>A und der phänotypisch erniedrigten Expression, die mit dem 2D6*41 Allel assoziiert ist. Weitere Experimente wurden zum Mechanismus der 2988G>A Mutation durchgeführt. In Experimenten zur mRNA-Stabilität und Reportergen-Analysen in transient transfizierten HepG2 und Huh7 Hepatomzellen wurden jedoch keine Hinweise auf veränderte RNA Abbaurate oder Transkriptionsrate gefunden, die auf diesen Polymorphismus zurückzuführen wären. In silico Analysen ergaben jedoch Hinweise darauf, dass der 2988G>A Austausch die Bindungsstelle für die Splicing-Faktoren SRp40 und SF2/ASF modifiziert.
Appears in Collections:03 Fakultät Chemie

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Diss_CT_final_doppelseitig_unistugt2.pdf1,18 MBAdobe PDFView/Open


Items in OPUS are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.