Untersuchungen zur Assemblierung der photosynthetischen Einheit von Rhodospirillum rubrum

Abstract

Die photosynthetische Einheit (PSU) des Purpurbakteriums Rhodospirillum rubrum, bestehend aus einem Reaktionszentrum (RC) und einem Lichtsammelkomplex (LH1), der dieses ringförmig umschließt, ist ein hervorragendes Modellsystem bei der Untersuchung makromolekularer Protein-Superkomplexe. Im Zuge der hier vorgelegten Arbeit wurde das puhB-Gen aus dem puh Operon von R. rubrum deletiert, da den Genen des puh Operons eine wichtige, wenn auch nicht essentielle Rolle bei der Assemblierung der PSU zugesprochen worden war (vgl. z. B. Wong et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 2334-2342). Der Phänotyp der erhaltenen puhB-Deletionsmutanten SPUHB15 (carotinoidhaltig) und GPUHB1 (carotinoidlos) wies einige Besonderheiten auf, die in puhB-Deletionsmutanten eines verwandten Purpurbakteriums, Rhodobacter capsulatus, nicht aufgetreten waren. So zeigten die R. rubrum puhB-Deletionsmutanten eine extrem hohe Sauerstoffempfindlichkeit, was, unter anderem, in einer Anhäufung von Sekundärmutationen während semi-aerober Inkubation im Dunkeln deutlich wurde. Es stellte sich heraus, dass vor allem die LH1-Komplexe der Mutanten sehr empfindlich gegenüber verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies waren, während sich die RCs als vergleichsweise stabil erwiesen. Dies deutete darauf hin, dass im Wildtyp PuhB mit dem LH1 interagiert. Verschiedene Spektroskopie-Experimente konnten schließlich einen Erklärungsansatz auf molekularer Ebene liefern. Bislang hatte ein LH1-Modell vorgeherrscht, bei dem der LH1-Ring aus 16 identischen Untereinheiten (bestehend aus jeweils zwei Polypeptidketten, zwei Bacteriochlorophyll-Molekülen und einem Carotinoid) zusammengesetzt ist. Der hier aufgestellten Hypothese nach ist das PuhB-Protein jedoch in diesen LH1-Ring eingebaut und ersetzt dabei eine der 16 Untereinheiten, d. h. der LH1-Ring besteht aus nur 15 Untereinheiten und einem PuhB-Protein. Wenn PuhB fehlt, so wird an seiner Stelle eine sechzehnte Untereinheit in den Ring eingebaut, was zu sterischen Behinderungen und damit einer Destabilisierung der LH1-Struktur führt. In der so veränderten LH1-Stuktur sind die Bacteriochlorophylle für reaktive Sauerstoffspezies leichter zugänglich und können somit leichter mit diesen reagieren, was zur Degradation des LH1 und damit der ganzen photosynthetischen Membran führen kann. In dieser Arbeit konnte außerdem mit Hilfe von Komplementierungsexperimenten nachgewiesen werden, dass das PuhB-Protein auch mit einer der drei Untereinheiten des RCs, der sogenannten H-Untereinheit, eng wechselwirkt. Die Interaktion von PuhB mit sowohl dem LH1 als auch dem RC könnte der Grund dafür sein, dass in vivo die PSUs von R. rubrum nahezu immer perfekt assembliert sind, d. h. RC und LH1 liegen im Verhältnis 1:1 vor, was bedeutet, dass es keine „leeren“ LH1-Ringe (ohne RCs) gibt. (In den puhB-Deletionsmutanten war mit Hilfe von Spektroskopie- und Gelelektrophorese-Experimenten ein relativer Überschuss von LH1-Komplexen im Vergleich zu den RCs nachweisbar gewesen.) Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass während der Photosynthese-Reaktionen PuhB wahrscheinlich auch am Transfer von Redoxäquivalenten (in Form von Ubichinon (UQ) und Ubichinol (UQH2)) durch den sonst geschlossenen LH1-Ring hindurch vom RC zum UQ/UQH2-Membranpool beteiligt ist, d. h. die bisher noch unklar definierte „Öffnung“ im LH1-Ring für den UQ-Transfer könnte in Gestalt des PuhB-Proteins vorliegen. In der vorliegenden Arbeit wird also ein neues PSU-Modell postuliert, in dem PuhB als integraler Bestandteil der PSU sowohl mit dem LH1-Komplex als auch dem RC interagiert und gleichzeitig einen erfolgreichen UQ-Tranfer durch den LH1-Ring gewährleistet.

The photosynthetic unit (PSU) of the purple bacterium Rhodospirillum rubrum, which consists of a light-harvesting complex 1 (LH1) surrounding a reaction centre (RC), is an advantageous model system for the examination of macromolecular protein-supercomplexes. In this study, the puhB-gene was deleted from the puh operon of R. rubrum, because it has been known before, that the genes of the puh operon play an important, but not essential, role during the assembly of the PSU (see for example Wong et al., 1996, J. Bacteriol. 178: 2334-2342). The phenotype of the puhB-deletion mutants SPUHB15 (carotenoid-containing) and GPUHB1 (carotenoidless) exhibited a unique peculiarity which had not been reported in puhB-deletion mutants of the purple bacterium Rhodobacter capsulatus, so far. The R. rubrum mutants were extremely sensitive to oxidative stress, indicated for example by the occurrence of a large number of secondary mutants during semi-aerobic growth in the dark. In particular, the LH1-complexes of the mutants were extremely sensitive to degradation due to reactive oxygen species, whereas the RCs were considerable stable during the same experiments. This could be interpreted by an interaction of PuhB with the LH1 in wildtype PSUs. A series of spectroscopic experiments gave rise to a molecular explanation, which challenged the present LH1 model, in which the LH1-ring consists of 16 identical subunits (each consisting of two polypeptide chains, two bacteriochlorophyll-molecules and one carotenoid, respectively). In my model, the PuhB-protein is integrated into the LH1-ring, thereby replacing one of the 16 subunits, which yields a LH1-ring consisting of only 15 subunits and one PuhB-protein. If PuhB is missing, its place in the ring is filled with a 16th subunit, which will lead to steric difficulties and destabilisation of the LH1-structure. In this altered structure, the bacteriochlorophylls will be more accessible for reactive oxygen species, which, ultimately, will lead to severe damage of the LH1 complex and the photosynthetic membrane. In this study, it could also been shown (by analysis of complementation experiments), that the PuhB-Protein interacts strongly with the H-subunit of the RC. Interaction of PuhB with both the LH1 and the RC could be an explanation for the observation, that, in vivo, the PSUs of R. rubrum are assembled perfectly: RC and LH1 are present in equal amounts, that means, “empty” LH1-rings (without RC) do not exist. (With spectroscopy and gel electrophoresis it could be shown, that there had been a higher amount of LH1-complexes compared to the RC-levels in the mutants.) Additionally, it could be shown, that, during photosynthesis, PuhB facilitates the transfer of redox equivalents (ubiquinone (UQ) and ubiquinol (UQH2), respectively) from the RC towards the UQ/UQH2-pool through the closed LH1-ring. Therefore, PuhB could be defined as the “quinone gate” which had remained elusive, so far. In this study, a new PSU model is shown, in which PuhB is an integral part of the PSU and interacts both with the LH1 and the RC, thereby facilitating UQ-transfer through the LH1.