Klonierung der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117

Abstract

Enantiomerenreiche D-Aminosäuren werden als Vorstufen für die industrierelevante Antibiotikaproduktion verwendet. Die Enzyme, die diese Reaktionen katalysieren werden als D-Hydantoinase und L-Carbamoylase bezeichnet. Ziel der Arbeit war es die molekularbiologischen Rahmenbedingungen zur Produktion der D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20017 zu etablieren. Die Klonierung der in der Literatur als instabil beschriebenen D-Carbamoylase sollte über die Klonierung der D-Hydantoinase erfolgen, die in der direkten Nachbarschaft der D-Carbamoylase vermutet wurde. Nach einer Fermentation wurde die D-Hydantoinase aufgereinigt und aus einem SDS-Gel eluiert. Nach einem tryptischen Verdau und der Auftrennung des Peptidgemisches über präparative HPLC wurden die sequenzierten Peptide zur Ableitung von Primern für eine degenerierte PCR verwendet. Dies führte zur Klonierung des ersten DNA-Abschnittes des D-Hydantoinasegens. Mit Hilfe der inversen PCR wurde weitere Bereiche des hyu-Operons sequenziert: die kompletten Leserahmen einer D-Hydantoinase, D- und L-Carbamolyase sowie die Teilsequenzen einer Permease und eines poteniellen Regulatorproteins. Die D-Carbamoylase wurde bezüglich des Substratspektrums, des Molekulargewichtes, pH- und Temperaturoptimums und der Metallabhängigkeit charakterisiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der katalytische Reaktionsmechanismus von bestimmten D- und L-Carbamoylase aufgeklärt. Hierzu wurden qualitative Assays für die Umsetzung verschiedener D,L-Carbamoyl-Phenylalanin-Derivaten etabliert, die an unterschiedlichen Positionen des Moleküls durch andere Atome oder Atomgruppen substituiert waren. Die Ergebnisse zeigen, dass D-Carbamoylasen die Decarbamoylierung durch einen Amidasemechanismus katalysieren, während L-Carbamoylasen eine 'echte' Decarbamoylierung des Substrates bewirken. Basierend auf den unterschiedlichen Umsetzungsdaten konnten für beide Katalysetypen die zugrundeliegenden Reaktionsmechanismen beschrieben werde.

Enantiomerically pure D-amino acids are used for the industrially relevant production of antibiotics. The enzymes necessary for this industrially relevant process are hydantoinases and d-carbamylases. Within the scope of this Phd thesis the molecular biological framework for the production of the d-carbamylase of Arthrobacter crystallopoietes DSM 20017 has been established. The d-carbamylase is a very unstable protein. Therefore - assuming an operon-like structure firstly the d-hydantoinase has been purified and the pursuant gene cloned. Following a fermentation of Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117, The hydantoinase was purified via multi-step chromatogrpaphy procedure. The protein was seperated in a SDS-Gel and excised. After proteolytic digestion the peptides were eluted and separated by praperative HPLC. After peptide sequencing the sequence information was used for degenerated PCR. This method was successfully applied to clone a first DNA segment of the hydantoinase gene. Inverse PCR was applied to clone further parts of the hyu-operon: complete orfs of the d-hydantoinase (hyuH), d-carbamylase (hyuCD) and l-carbamylase (hyuCL) and partial sequences of a permease (hyuP) and a potential regualtor protein (orf1). The d-carbamoylase has been characterized in respect of substrate specifity, molecular weigth, pH and temperature optimum as well as metal dependency. The second part of the Phd thesis was to resolve the katalytic reaction mechanism of d- and l-carbamylases. Therefore qualitative assays for the degradation of d,l-carbamyl-phenylalanine derivatives have been established. These were systematically substituted at diffrent positions of the molecule by other atoms or functional groups. The results proove d-carbamoylases catalysing the decarbamylation following an amidase-like mechanism, wheras l-carbamoylases perform a 'real' decarbamylation reaction.