Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum : Identifizierung und Charakterisierung von Komponenten des Abbaus missgefalteter sekretorischer Proteine

Abstract

Das endoplasmatische Retikulum (ER), der Faltungsort von Proteinen des sekretorischen Systems, besitzt ein komplexes Netzwerk faltungsunterstützender und kontrollierender Proteine. Sekretorische Proteine, die ihre endgültige räumliche Konformation jedoch nicht erlangen, werden dem Ubiquitin-Proteasom-System zum Abbau zugeführt. Dieser Prozess wird im Allgemeinen mit ER-Degradation oder ER-assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden drei zur endoplasmatischen Proteinqualitätskontrolle gehörende Themengebiete bearbeitet: Als erstes wurde die Klonierung des bisher unbekannten DER7 Gens mit Hilfe der isolierten ERAD Mutante der7-1 durchgeführt. Danach erfolgte eine weitergehende Charakterisierung des Der1 Proteins und der Vergleich mit den Der1-Homologen Ydr411c (S. cerevisiae) und R151.6 (C. elegans). Zuletzt wurde der Einfluss einiger zytosolischer Chaperone auf den Abbau des ERAD Modellsubstrats CPY* untersucht. Die bisher nicht charakterisierte ERAD Mutante der7-1 bewirkt einen verlangsamten Abbau der ERAD Substratproteine CPY* und PrA*. Zusätzlich ist die Beweglichkeit dieser Proteine im elektrischen Feld verringert. Es konnte gezeigt werden, dass dies auf eine defekte Prozessierung der N-Glykoside im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen ist. Durch Kreuzen des der7-1 Allels mit Nullmutanten von Glukosidase I und II, durch Komplementation mit plasmidkodierter Glukosidase I und durch meiotische Kartierung wurde gefunden, dass DER7 mit CWH41 identisch ist. CWH41 kodiert für das Enzym Glukosidase I, welches bei der Prozessierung der Oligosaccharide im endoplasmatischen Retikulum einen terminalen alpha1,2-Glukoserest entfernt. Korrekt getrimmte Oligosaccharide scheinen daher für eine effiziente Proteindegradation notwendig zu sein. Das bestätigt sich durch den, für Doppelmutanten des ERAD und der „unfolded protein response“ (UPR) typischen, temperaturabhängigen Wachstumsdefekt von der7-1 deltaire1 Mutanten. Das Protein Der1 wurde schon in früheren Arbeiten als eine Komponente der ERAD-Maschinerie identifiziert. Bisher wurde jedoch eine Beteiligung nur am Abbau einiger löslicher missgefalteter Proteine nachgewiesen. Durch den Vergleich des Der1 abhängigen Abbaus von löslicher CPY* und membranständigem CTG* (CPY*-Transmembrandomäne-GFP) konnte nun gezeigt werden, dass die Funktion von Der1 unabhängig von der Missfaltung ist und sich wahrscheinlich auf die Degradation löslicher Proteine beschränkt. Eine topologische Charakterisierung von Der1 zeigte, dass der N- und der C-Terminus im Zytosol lokalisiert sind und Der1 insgesamt vier Transmembrandomänen besitzt. Es wurde außerdem gefunden, dass Der1 sehr empfindlich auf Veränderungen am Protein reagiert. Einzig kleinere Modifikationen des C-Terminus, wie das Einfügen eines einzelnen HA-Epitops oder einer N-Glykosylierungs-Konsensussequenz, erhalten die Funktionalität des Proteins. Um potentielle Interaktionspartner von Der1 zu finden, wurde nach High-Copy-Suppressoren der Temperatursensitivität von der1-2 deltaire1 Doppelmutanten gesucht. Es wurden 19 Genbankplasmide erhalten, die im Genbankinsert weder DER1 noch IRE1 enthielten. Ihre Wirkungsweise ist jedoch möglicherweise indirekt, da der Abbau von CPY* durch ihre Expression in der1-2 Mutanten nicht wiederhergestellt wurde. Die fortschreitende Genomsequenzierung ermöglichte inzwischen die Identifizierung einer „Der1-ähnlichen“ Familie mit mehr als 15 Vertretern aus den unterschiedlichsten Organismen. Zwei dieser homologen Proteine sind Ydr411c aus S. cerevisiae und R151.6 aus C. elegans. Das Der1 homologe Protein Ydr411c wurde wegen seiner Zugehörigkeit zur „Der1-ähnlichen“ Familie Dfm1 (Der1-like family member) benannt. Ebenso wie Der1, besitzt Dfm1 einen zytosolischen C-Terminus und ist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Im Gegensatz zur deltader1 deltaire1 Doppelmutation, führt die deltadfm1 deltaire1 Doppeldeletion jedoch nicht zu temperatursensitiven Hefestämmen. Des Weiteren konnte nur ein äußerst schwacher Einfluss von Dfm1 auf den Abbau des ERAD Substrats CPY* festgestellt werden. Das C. elegans Protein R151.6 hingegen, scheint dieselbe Funktion wie Der1 der Hefe auszuüben. Seine heterologe Expression in deltader1 deltaire1 Doppelmutanten hob die konditionale Letalität dieses Stamms auf. Das deutet darauf hin, dass die Funktion von Der1 auch in höheren Organismen konserviert ist. Als weiteres stellte sich die Frage ob die zytosolischen Chaperone der Hsp90 und Hsp100/Clp am Abbau löslicher ERAD Substrate beteiligt sind. Die in dieser Arbeit getesteten deltahsc82, deltahsp82, deltasti1, deltasba1 und deltahsp104 Nullmutanten zeigten jedoch keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit von CPY*. Ob zytosolische Chaperone generell nur beim Abbau von Membransubstraten eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.

The endoplasmic reticulum (ER) of eukaryotic cells is the organelle where all secretory and membrane proteins have to fold into their native structure. Therefore, it occupies an elaborate chaperone and quality control system supporting and monitoring folding of proteins. Proteins, which fail to fold properly, are targeted for destruction by the ubiquitin-proteasome system (ER-associated degradation, ERAD). This work describes the cloning and characterization of the yet unknown ERAD gene DER7 using the der7-1 mutant. Furthermore, it gives new insights into the structure and the function of the ERAD component Der1 and the Der1-like proteins Ydr411c/Dfm1 of S. cerevisiae and R151.6 of C. elegans. In addition, it investigates the involvement of cytoplasmic chaperones of the Hsp90 family, Hsp90 co-chaperones and the Hsp104 chaperone in the degradation of the soluble ERAD substrate CPY*. The yet unknown mutant der7-1 was recently isolated from a screen for strains defective in degradation of the short-lived proteins CPY* and PrA*. As an additional phenotype, this mutant also alters the electrophoretic mobility of glycoproteins. We assumed that defective trimming of the N-glycans in the ER to be the cause of this molecular mass increase. Indeed, the mobility of glycoproteins is comparably decreased in der7-1 and deltacwh41 single mutants. This slower migration of glycoproteins is also observable in heterozygous der7-1/deltacwh41 diploids, implying that der7-1 and CWH41 are allelic genes. Finally, expression of CWH41 in the der7-1 mutant and genetic mapping of the der7-1 allele demonstrates that DER7 and CWH41 are identical genes. CWH41 encodes the enzyme glucosidase I removing the terminal alpha1,2-glucose residue during N-linked oligosaccharide processing in the ER. Therefore, properly trimmed oligosaccharides seem to be necessary for efficient ERAD of glycoproteins. This additionally appearing stress leads to temperature dependent growth of der7-1 deltaire1 double mutants, a typical phenotype of double mutants with defective ERAD and unfolded protein response (UPR). One of the first identified and characterized components of the ER degradation machinery was the Der1 protein. However, Der1 participation in ERAD could only be demonstrated for soluble degradation substrates. Examination of the Der1 dependent degradation of soluble CPY* and the membrane bound variant CTG* (CPY*-transmembrane domain-GFP) reveals that the function of Der1 is not the recognition of the misfolded CPY* domain. Instead, Der1 seems to be preferentially required for the degradation of soluble substrate proteins. Structural analysis of Der1 yields a final structure with cytoplasmic N- and C-termini, separated by four transmembrane segments. Functional examinations reveal that its hydrophilic segments are highly sensitive to modifications. Nevertheless, small modifications at the C-terminus, for example addition of a single HA epitope or insertion of a N-glycosylation consensus sequence, are tolerated and do not disturb the Der1 activity. High copy suppression of the conditional lethality of a der1-2 deltaire1 strain was used to search for possible Der1 interacting proteins. However, none of the 19 isolated candidates was able to restore degradation of CPY* in a der1-2 single mutant, thereby indicating that their effect might be Der1 in dependent. Database searches resulted in more than 20 Der1 orthologous proteins partially belonging to the Der1-like family (Pfam domain PF04511; Pfam, Sanger Institute; www.sanger.ac.uk). Among them are the proteins R151.6 from C. elegans and uncharacterised Ydr411c from S. cerevisiae. Because of its homology to Der1, Ydr411c was named Dfm1 (Der1-like family member). Localization of Dfm1 shows that it is an ER protein with a cytosolic C-terminus. Despite these similarities with Der1, Dfm1 displays enlarged cytoplasmic protein segments implying a different cytosolic and/or cellular function. In fact, deltadfm1 deltaire1 double mutants do not display a conditional growth phenotype, as observed for double mutants defective in ERAD and UPR. In consistence, degradation of the ERAD substrate CPY* is only mildly affected. In contrast to Dfm1, the C. elegans protein R151.6 seems to be a functional homologue of Der1. Expression of R151.6 in yeast rescued the conditional lethality of a deltader1 deltaire1 double deletion strain, suggesting that the function of Der1 is conserved in higher eukaryotes. Former investigations demonstrated the involvement of cytoplasmic chaperones of the Hsp70 and Hsp90 families in proteasomal degradation of membrane proteins. Here it is tested whether these proteins also participate in turnover of soluble CPY*. However, non of the tested deltahsc82, deltahsp82, deltasti1, deltasba1 und deltahsp104 null mutants exhibit impaired the degradation of CPY* showing that these proteins are not part of the degradation machinery for soluble substrate proteins.