The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis

Abstract

Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.

Seit mehreren Jahrzehnten wurde vermehrt vom Auftreten sogenannter Algenblüten berichtet. Diese Algenblüten deren Ursprung in der übermäßigen Vermehrung einiger Cyanobakterien liegt, können im Meer genauso auftreten wie in Süßwasser. Die genauen Hintergründe dieses Phänomens sind nicht vollständig geklärt; Nährstoffverfügbarkeit, Limitierungen und Überschüsse spielen jedoch eine wesentliche Rolle. Durch die Verfügbarkeit von Phosphor, Stickstoff, Schwefel und Eisen in bestimmten Verhältnissen wird das Algenwachstum stark gefördert. Aufgrund der verschiedenen negativen Auswirkungen der Algenblüten, u. a. die Freisetzung von Leber- und Neurotoxinen, ist ein tieferes Verständnis der Zusammenhänge notwendig um schließlich das Auftreten von Algenblüten bereits in ihrer Entstehung vorhersagen zu können. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung biotechnologischer Tools zur Beobachtung und Vorhersage von Algenblüten. Zur Vertiefung des Verständnisses des Verhaltens dieser Mikroorganismen bei niedrigen Nährstoffkonzentrationen, wird als Frühwarnsystem vor Algenblüten bei niedrigen Nitratkonzentrationen ein mikrobieller Test entwickelt und die Analyse der physiologische Änderung auf Basis von Transkriptom- und Proteomdaten wird aufgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit zum Nachweis der Nitratverfügbarkeit in Wasser verwendete Reporter-Stamm wurde auf Basis des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 hergestellt. Durch Fusion des Gens dessen Expression durch Nitratlimitierung induziert wird, mit einem bakteriellen Biolumineszenz-Operon wurde ein Konstrukt erzeugt, das in Abhängigkeit von der Nitratkonzentration Licht emittiert: Hierzu wurde dargestellt, zunächst das Kanamycin Resistenzgen (kmR) mit dem Luciferase-Operon luxAB aus Vibrio harveyi fusioniert und der entstandene Komplex luxAB-kmR dann mit dem nblA1 Gen von Synechocystis fusioniert und in dessen chromosomale DNA inseriert (PnblA::luxABkmR). Der so entstandene Stamm N1LuxKm zeigte im Bereich von 4-100 µM Nitrat ein konzentrationsabhängiges Lumineszenzsignal und konnte nach Immobilisierung in Mikrotiterplatten als Biosensor für ca. einen Monat gelagert werden. Hierzu wurde N1LuxKm in "gewaschenem Agar" immobilisiert und in Proben die unterschiedliche Nitratkonzentrationen enthielten für 10 Stunden bei kontinuierlicher Beleuchtung (50 µE.m-2.s-1) inkubiert. In Kombination mit ökologischen und physiologischen Daten kann dieser Sensor als Frühwarnsystem zur Vorhersage von Algenblüten eingesetzt werden. Die Analyse und Identifikation der während der Veränderung der Zellfärbung von blau-grün zu gelb des Cyanobakteriums bei Nitratmangel induzierten Proteine durch Proteomics könnte das Verständnis der Vorgänge vertiefen und gleichzeitig Zugang zu neuen Biosensoren ermöglichen. Hierfür wurden die löslichen Proteine von Synechocystis PCC 6803 aus Kulturen mit Nitratmangel und -überschuß extrahiert und durch zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt. Zur Identifizierung wurden ausgewählte Proteine im Gel mit Trypsin geschnitten, anschließend die entsprechenden Spots aus den Coomassie-gefärbten Gelen ausgeschnitten und die Peptide durch HPLC und Massenspektrometrie analysiert. Alternativ wurden die Protein-Spots auf eine PVDF-Membran durch Elektro-Blotting übertragen und N-terminal ansequenziert. Vier Proteine die durch Nitratmangel induziert wurden, konnten damit identifiziert werden: Zwei Isoformen des "Stickstoff-Regulator Proteins P-II" welches durch das glnB Gen codiert wird, das "carbon dioxide concentrating mechanism protein", das durch das ccmK Gen codiert wird und das Plastocyanin welches durch das petE Gen codiert wird. Aufgrund zu geringer Konzentrationen oder blockierter N-Termini konnten jedoch nicht alle interessierenden Proteinspots der 2D-Gele analysiert werden. Aufgrunddessen wurde im weiteren Verlauf des Projekts ein DNA-Microarray hergestellt, der eine Reihe von Synechocystis-Genen enthält, deren Regulation in Abhängigkeit der Nitratverfügbarkeit somit auf Transkriptionsebene parallel analysiert werden kann. RNA wurde von Zellen isoliert und daraus durch RT die cDNA synthetisiert. Die cDNAs der verschiedenen Proben wurden hierbei mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Anschließend wurden gleiche Mengen an cDNA der Proben die mit und ohne Nitrat kultiviert wurden auf den Arrays hybridisiert. Die Gene der durch Proteomics bereits identifizierten Proteine wurden wie erwartet durch Nitratmangel induziert. Auch das nblA Gen, das im ersten Teil der Arbeit zur Herstellung des mikrobiellen CyanoSensors verwendet wurde, wurde exprimiert, stärker jedoch wurde das in der Literatur beschriebene ntcA Gen induziert, welches das "globale Stickstoff Regulationsprotein" codiert. Sämtliche Gene deren Produkte nach einiger Zeit des Nitratmangels degradierten, wurden wie in der Literatur beschrieben nicht exprimiert.