Determining the functions of transcriptional regulatory genes of the npd gene cluster encoding 2,4,6-trinitrophenol degradation in Rhodococcus opacus HL PM-1

Abstract

Rhodococcus opacus HL PM-1 utilises 2,4,6-trinitrophenol (TNP) and 2,4-dinitrophenol (DNP) as a sole carbon, nitrogen and energy source. The TNP metabolic enzymes are encoded by the npd gene cluster. The initial attack on TNP is two hydrogenation reactions, which are catalysed by hydride transferase I (encoded by npdC) and hydride transferase II (encoded by npdI) and the NADPH-dependent F420 reductase (encoded by npdG). In this work, three open reading frames, orfA1, orfA2 and npdR were of interest. Database searches with the deduced amino acid sequences from npdR, orfA1 and orfA2 suggested that npdR may encode for a transcriptional regulator of the IclR family, and orfA1 and orfA2 may encode for two components of a signal transduction protein. The npdR gene was expressed in E. coli, the protein was purified and shown to bind to intergenic regions between orfA1 and orfB, and between npdH and npdI. DNP, TNP, 2-chloro-4,6-dinitrophenol, and 2-methyl-4,6-dinitrophenol induced the expression of npdI and npdC by reducing the binding affinity of NpdR to the DNA-binding regions. Both intergenic regions were cloned upstream of a reporter gene (xylE), causing the expression of xylE. Hence, both intergenic regions contain promoters. Two direct repeats were identified immediately downstream of the two promoter regions. Gel retardation assays with one of the direct repeats between orfA1 and orfB demonstrated that it was the binding site for NpdR. The sequences of the two direct repeats were 82 % identical, suggesting that the second direct repeat between npdH and npdI may be a second binding site for NpdR. This coincided with gel retardation assays, which showed that NpdR might bind to two sites in each intergenic region. A deletion mutant for npdR in R. opacus HL PM-1 was constructed, in which an internal part of npdR was deleted. The expression of npdC and npdI were induced by DNP in the wild-type strain, but were constitutive in the mutant. Hence, NpdR is a repressor involved in TNP degradation. In vivo deletion mutants for orfA1 or orfA2 were also constructed, in which the entire orfA1 or a part of orfA2 was deleted. If orfA1 and orfA2 encode for transcriptional regulators involved in TNP degradation, an effect on expression of the npd genes or on the growth with TNP would be expected in the mutants. However, there was no change in the expression of npdC or npdI in both mutant strains. Resting cells of the deletion mutants for orfA1 or orfA2 with TNP as a substrate did not show any difference in TNP conversion compared to the wild-type cells. Further growth rate of the mutants on TNP as nitrogen source was also similar to that of the wild-type strain. In order to eliminate the possibility of a second copy of orfA1 or orfA2 with full activity in strain HL PM-1, the location of npd genes was determined. npdC, npdI, npdR, orfA1 and orfA2 were localised on the chromosomal DNA in strain HL PM-1. Hybridisation analysis of total DNA from strain HL PM-1 with npdR, orfA1 or orfA2 probes revealed that these genes are present as a single copy in the strain. Hence, orfA1 and orfA2 seem not to be involved in TNP degradation. To conclude, it was shown that NpdR is a repressor of TNP degradation, that two promoter regions are present in the npd gene cluster, and that orfA1 and orfA2 are not involved in metabolism of TNP as nitrogen source.

Rhodococcus opacus HL PM-1 verwendet 2,4,6-Trinitrophenol (TNP) und 2,4-Dinitrophenol (DNP) als einzige Kohlenstoff-, Stickstoff- und Energiequelle. Die TNP abbauenden Enzyme werden von dem npd-Gencluster kodiert. Der TNP-Abbau beginnt mit zwei Hydrierungsreaktionen. Diese werden von der Hydridtransferase I (kodiert von npdC), der Hydridtransferase II (kodiert von npdI) und der NADPH-abhängigen F420 Reduktase (kodiert von npdG) katalysiert. In dieser Arbeit wurden drei offene Leserahmen orfA1, orfA2 und npdR untersucht. Datenbankvergleiche der Aminosäuresequenzen deuteten darauf hin, dass npdR für einen Regulator der IclR-Familie kodiert und orfA1 und orfA2 wahrscheinlich für Signaltransduktionsproteine kodieren. Das npdR Gen wurde in Escherichia coli überexprimiert und das Protein aufgereinigt. Es wurde gezeigt, dass NpdR an die DNA in den intervenierenden Regionen zwischen orfA1 und orfB und zwischen npdH and npdI bindet. DNP, TNP, 2-Chlor-4,6-dinitrophenol und 2-Methyl-4,6-dinitrophenol induzierten die Expression von npdC und npdI indem sie die Affinität von NpdR zu den oben genannten DNA Regionen herabsetzten. Beide DNA Bereiche wurden vor ein Reportergen (xylE) kloniert und führten zur Expression von xylE. Demnach enthalten beide Bereiche Promotoren. Zwei sich wiederholende Sequenzen („direct repeats“) folgen unmittelbar auf die zwei Promotorbereiche. Gelretentionsanalysen mit einem der beiden „direct repeats“ zwischen orfA1 und orfB zeigten, dass dieses die Bindungsstelle für NpdR ist. Die Wiederholungssequenzen waren zu 82% identisch, was darauf hindeutet, dass es sich bei dem zweiten Bereich ebenfalls um eine Bindungsstelle von NpdR handeln könnte. Es wurde durch Gelretentiosnanalysen bestätigt, dass NpdR jeweils an zwei Stellen der beiden intervenierenden Regionen binden kann. Es wurde eine Deletionsmutante konstruiert, indem eine innere Teilsequenz von npdR in R. opacus HL PM-1 deletiert wurde. Im Wildtypstamm wurde die Expression von npdC und npdI durch DNP induziert, hingegen war die Expression in der Deletionsmutante konstitutiv. Folglich ist NpdR ein Repressor, der am TNP Abbau beteiligt ist. Es wurden auch Deletionsmutanten von orfA1 und orfA2 hergestellt. Dabei wurde der gesamte orfA1 oder ein Teil von orfA2 deletiert. Wenn orfA1 und orfA2 als Transkriptionsregulatoren am TNP Abbau beteiligt sind, dann sollte die Expression der npd Gene oder Wachstum auf TNP in den Mutanten beeinträchtigt sein. Keine der beiden Deletionsmutanten zeigte eine veränderte Expression von npdC oder npdI. Ruhezellen der Deletionsmutanten mit TNP als Substrat unterschieden sich nicht im TNP Abbau von Wildtypzellen. Auch die Wachstumsraten der Mutanten auf TNP als Stickstoffquelle waren ähnlich zu denen des Wildtyps. Um die Möglichkeit einer weiteren aktiven Kopie von orfA1 und orfA2 im Stamm HL PM-1 auszuschließen, wurden die npd Gene lokalisiert. Es zeigte sich, dass npdC, npdI, npdR, orfA1 und orfA2 sich auf der chromosomalen DNA des Stamms HL PM-1 befinden. Hybridisierung von der gesamten DNA vom Stamm HL PM-1 mit Sonden gegen npdR, orfA1 oder orfA2 zeigten, dass diese Gene nur als einfache Kopie in diesem Stamm vorliegen. Folglich scheinen orfA1 und orfA2 nicht am TNP Abbau beteiligt zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NpdR ein Repressor für den TNP Abbau ist, dass zwei Promotorregionen im npd Gencluster vorhanden sind und, dass orfA1 und orfA2 nicht am Stoffwechsel von TNP als Stickstoffquelle beteiligt sind.