Der Citronellolstoffwechsel in Pseudomonaden - Funktionelle Zuordnung beteiligter Gene und deren Produkte

Abstract

Citronellol und Geraniol sind in der Natur als Duftstoffe weit verbreitete azyklische Terpenoide, die aufgrund ihrer β-ständigen Methylgruppe nicht über β-Oxidation abgebaut werden können. In jüngster Zeit konnten zwei in den Citronellolabbau involvierte Gencluster in P. aeruginosa PAO1 identifiziert werden, das atu (acyclic terpene utilisation)- und das liu (leucine/isovalerate utilisation)-Gencluster (FÖRSTER-FROMME ET AL., 2006, HÖSCHLE ET AL., 2005). Bisher konnten nur die Gene der in den Citronellolstoffwechsel involvierten Carboxylasen funktionell identifiziert werden (HÖSCHLE ET AL., 2005). In dieser Arbeit wurden weitere Gene der Cluster funktionell zugeordnet. - In P. citronellolis wurde ein Gencluster (atuABCDEFGH) identifiziert und sequenziert, dessen Gene sehr hohe Identitäten zu den atu-Genen von P. aeruginosa PAO1 aufwiesen. Dieses Gencluster wurde als atu-Gencluster von P. citronellolis annotiert. Eine Insertionmutante in atuA zeigte, daß dieses Gen essentiell für den Citronellolabbau ist. - In P. citronellolis konnte anhand zweier Transposonmutanten in mqoB gezeigt werden, daß die Malat-Quinon-Oxidoreduktase (MqoB) eine essentielle Rolle beim Abbau von Terpenoiden spielt, da die Endprodukte des Citronellolabbaus in den Glyoxylatstoffwechsel eingehen und die Malat-Quinon-Oxidoreduktase ein essentielles Enzym dieses Stoffwechselweges ist. - In P. aeruginosa PAO1 konnte die Funktion der Citronellyl-CoA-Dehydrogenase AtuD zugeordnet werden. AtuD wurde exprimiert und gereinigt und eine spezifische Aktivität von 850 ± 37 mU/mg für den Umsatz von Citronellyl-CoA ermittelt. Der KM-Wert für Citronellyl-CoA beträgt 1,6 ± 0,3 µM. Das Reaktionsprodukt Geranyl-CoA wurde mit HPLC und Massenspektrometrie nachgewiesen. AtuD ist hochspezifisch für Citronellyl-CoA, da Isovaleryl-CoA oder Octanoyl-CoA nicht umsetzt werden. Durch 2D-Gelanalysen wurde eine weitere Acyl-CoA-Dehydrogenase als spezifisch beim Wachstum auf Terpenoiden erkannt und als PA1535-Genprodukt identifiziert. Das PA1535-Genprodukt wurde heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und die Substratspezifität bestimmt. Das Enzym setzte Citronellyl-CoA mit 2450 ± 26 mU/mg (KM-Wert 18 ± 1,1 µM) und Octanoyl-CoA mit 610 ± 10 mU/mg (KM-Wert 130 ± 9,8 µM) um. Isovaleryl-CoA stellt kein geeignetes Substrat dar. - In P. aeruginosa PAO1 wurde die Funktion der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase LiuA zugeordnet. Gereinigtes LiuA setzte Isovaleryl-CoA mit 1620 ± 55 mU/mg (KM-Wert 2,3 ± 0,4 µM) um. Langkettige CoA-Thioester wie Citronellyl-CoA oder Octanoyl-CoA wurden nicht umgesetzt. - In P. aeruginosa PAO1 wurde das stromaufwärts des atu-Genclusters liegende Gen (PA2885) durch Insertionsmutangenese als Repressor des atu-Genclusters identifiziert (atuR). AtuR gehört zur TetR-Familie. In dem intergenischen Bereich zwischen atuR und atuA (280 bp) wurde eine Region mit Ähnlichkeit zu σ-70 Promotoren sowie partiell überlappend zwei perfekte inverted repeats gefunden. Heterolog exprimiertes und gereinigtes AtuRHis6 war in der Lage, in Gelshift-Experimenten spezifisch an den intergenischen Bereich zu binden. Für eine vollständige Bindung waren beide inverted repeats, nicht aber die -10- und die -35-Region notwendig. Citronellol, Geraniol, Citronellal, Geranial, Citronellsäure und Geranylsäure, nicht aber Leucin, Isovaleriansäure, 3-Methylcrotonsäure, Phytol und Eukalyptol verhinderten die Bindung von AtuR und stellen somit offenbar Effektoren von AtuR dar. - Mithilfe von Proteomanalysen wurde gezeigt, daß sechs von acht Atu-Proteinen und vier von fünf Liu-Proteinen spezifisch beim Wachstum auf azyklischen Terpenen, bzw. Isovalerat gebildet werden. Des weiteren wurden 16 weitere Proteine identifiziert, die vermutlich ebenfalls am Citronellolstoffwechsel beteiligt sind. - Bei P. aeruginosa POA1 wurden alle Gene des atu-Genclusters durch Insertion von pKnockout-G (WINDGASSEN ET AL., 2000) inaktiviert. Es wurde gezeigt, daß fünf der atu-Gene (atuA, atuB, atuC, atuD, atuF) essentiell für den Citronellolabbau waren. Insertionsmutanten in atuE, atuG und atuH zeigten keinen Phänotyp.

Citronellol and geraniol are widespread scents with acyclic terpenoid molecule structures in nature. Because of their β-methyl-branched carbon skeleton they can not be degraded via β-oxidation. Recently two gene clusters involved in the citronellol degradation pathway could be identified in P. aeruginosa PAO1, the atu (acyclic terpene utilisation)- and the liu (leucine/isolvalerate utilisation)-gene cluster (FÖRSTER-FROMME ET AL., 2006, HÖSCHLE ET AL., 2005). Up to now only genes coding the carboxylases involved in the citronellol degradation pathway could be identified (HÖSCHLE ET AL., 2005). In the present work several other genes of the gene clusters were functionally assigned. - A gene cluster (atuRABCDEFGH) was identified and sequenced in P. citronellolis; the genes showed very high similarities to the atu-genes of P. aeruginosa PAO1. An insertion mutant in atuA was unable to utilise acyclic terpenes and indicated that this gene is essential for citronellol degradation. - Investigation of two P. citronellolis transposon mutants in mqoB showed that the malate:quinone oxidoreductase (MQO) plays an essential role in the degradation of terpenoids. The end products of the citronellol degradation pathway enter the glyoxylate cycle and MQO is an essential enzyme of this pathway. - In P. aeruginosa PAO1 the function of the citronellyl-CoA-dehydrogenase was assigned to AtuD. AtuD was expressed, purified and a specific activity of 850 ± 37 mU/mg for citronellyl-CoA was determined. The KM value for citronellyl-CoA is 1,6 ± 0,3 µM. The reaction product geranyl-CoA was identified by mass spectrometry. AtuD is highly specific for citronellyl-CoA while it is inactive with isovaleryl-CoA and octanoyl-CoA. 2D-gel-analysis showed that an additional acyl-CoA-dehydrogenase was expressed specifically during growth on terpenoids and it was identified as PA1535 gene product. The PA1535 gene product was expressed in E. coli, purified and its substrate specifity was determined. The enzyme converted citronellyl-CoA with 2450 ± 26 mU/mg (KM value18 ± 1,1 µM) and octanoyl-CoA with 610 ± 10 mU/mg (KM value130 ± 9,8 µM). The enzyme was inactive with isovaleryl-CoA. - The function of the isovaleryl-CoA-dehydrogenase was assigned to LiuA in P. aeruginosa PAO1. LiuA was expressed and converts isovaleryl-CoA with 1620 ± 55 mU/mg (KM value 2,3 ± 0,4 µM). LiuA was inactive with long chain acyl-CoA thioesters like citronellyl-CoA or octanoyl-CoA. - The gene upstream of the atu-gene cluster (PA2885) was identified as the repressor of the atu-gene cluster (AtuR) in P. aeruginosa PAO1. AtuR is a member of the TetR family. An area with similarities to σ-70 promoters and partial overlapping two perfect inverted repeats was identified in the intergenic region between atuR and atuA (280 bp). Heterologically expressed and purified AtuRHis6 was able to bind specifically to the intergenic region in gel shift experiments. Both inverted repeats but not the -10 and the -35-region were necessary for complete binding. Citronellol, geraniol, citronellal, geranial, citronellate and geranylate but not leucine, isovaleric acid, 3-methylcrotonic acid, phytol and eucalyptol prevented AtuR from binding and apparently represent the effectors of AtuR. - Proteom analysis showed that six of eight Atu-proteins and four of five Liu-proteins were specifically expressed during growth on acyclic terpenes and isovalerate, respectively. Furthermore 16 additional proteins were identified which are supposed to be involved in the citronellol degradation pathway. - All atu-genes of the atu-gene cluster were inactivated by insertion of pKnockout-G (WINDGASSEN ET AL., 2000) into the genes in P. aeruginosa PAO1. Five of them (atuA, atuB, atuC, atuD, atuF) turned out to be essential for citronellol utilisation. Insertion in atuE, atuG and atuH showed no phenotype.