The active subunits of the 20S Proteasome in Saccharomyces cerevisiae : mutational analysis of their specificities and a C-terminal extention

Abstract

The proteasome is a large multi-subunit complex ubiquitous in eukaryotes and archaebacteria. It contains proteolytic subunits that function simultaneously to digest protein substrates into oligopeptides. In eukaryotic cells, it is involved in the removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, but additionally it has regulatory functions. For example it is responsible for the degradation of cyclins in cell-cycle control and for the destruction of transcription factors or metabolic enzymes in metabolic adaptation. Finally, the proteasome is also involved in MHC (major histocompatibility complex) class I mediated cellular immune response. These cellular functions are linked to an ubiquitin- and ATPrequiring protein degradation pathway involving the 26S proteasome whose proteolytic core is formed by the 20S proteasome. The 20S proteasome has a cylindrical shape and is composed of four rings, each formed by seven α- or seven β-subunits and stacked in the order αββα. In eukaryotic cells, the 20S proteasome is composed of two copies of 14 different subunits, 7 distinct α-type and 7 distinct β-type subunits. Only three of the β-type subunits are proteolytically active and have N-terminal threonine residues acting as nucleophiles. They differ in their major specificities: β5/Pre2, β2/Pup1 and β1/Pre3 are classified as having "chymotrypsin-like", "trypsin-like" and "peptidylglutamyl peptide hydrolysing" (PGPH or caspase-like) activities, respectively. This classification is based on the preferred amino acid residues found at the site of hydrolysis in peptide or protein substrates. These three active β-type subunits have a fixed location in the proteasome, with the two β5/Pre2 copies separated from the clustered β2/Pup1 and β1/Pre3 subunits. In yeast a hierarchy of individual subunit activities for proteasomal function was established: β5/Pre2>> β2/Pup1 > β1/Pre3. Part of this work aimed at clarifying whether this hierarchy is solely dependent on the specificities or whether topological conditions lead to the dominance of the β5/Pre2 activity over the others, which could involve inter-subunit communication mediated by interjacent inactive β-subunits. Stepwise site-directed mutagenesis of key residues forming the substrate binding pockets was used to swap specificities between the yeast β5/Pre2 and β1/Pre3 active sites. Consequences of these mutations were then analysed in regard to maturation of the modified subunits, their specificities towards peptide substrates diagnostic for chymotrypsin-like and PGPH activity and changes in their rank in the hierarchy of functional importance. By mutating the key residue methionine 45 into an arginine, the β5/Pre2 was able to mature and showed some PGPH activity. Combinations with mutant strains, having the other active subunits inactivated, revealed that Pre2 lost its functional dominance. When other key residues were additionally replaced by those present in β1/Pre3 (A20T, V31T, I35T), instead of an further increase in PGPH activity, the β5/Pre2 subunit showed an overall decrease in activity. An unexpected exception was the pre2-M45R-I35T mutant with a strong increase in chymotrypsin-like activity. Maturation of the Pre2 subunit occurred normally like in wild-type in all combinations of mutations tested. When the residue arginine 45 was mutated into a methionine in Pre3, this subunit lost any detectable peptidase activity. Attempts to stabilise the methionine 45 by introducing strategic point mutations at residue 52 were unsuccessful. Additional alterations in the substrate binding site of β1/Pre3 (T20A, T31V, T35I) completely abolished the autolytic maturation and thus any gain of activity. Strains lacking both the Pre3 propeptide and Nα-acetyltransferase were used to confirm that the mutations result in activity loss, even when the autolytic removal of the propeptide was not required. In a second project, the role of the long C-terminal extension of the yeast β2/Pup1 subunit was examined. This 37 amino acid structure embraces the β-ring neighbor subunit β3/Pup3 and reaches the next subunit β4/Pre1. It also contacts β7/Pre6 of the opposite β-ring. Mutations of residues that could loosen contact to the surface of β3/Pup3 (Y204A, R208G and T211A) where without effect. Complete deletion of this extension or truncation of 25 residues was lethal and deletion of the last 20 amino acids caused a strong cell growth defect. When replacing the last 20 amino acids of this C-terminal extension by a FLAG tag, the growth phenotype was lost. The lethal mutations were over-expressed in wild type strains, but the mutated β2 subunits did not incorporate into proteasomes. This indicates that removal of the distal half from the β2/Pup1 C-terminal extension impedes the integration of this subunit during early assembly stages of the 20S proteasome.

Proteasomen sind große Komplexe aus vielen Untereinheiten und ubiquitär in Eukaryonten und Archaebakterien. Sie enthalten proteolytische Untereinheiten, die gemeinsam beim Abbau von Proteinsubstraten zu Oligopeptiden agieren. In eukaryontischen Zellen sind sie beteiligt an der Beseitigung von abnormalen, fehlgefalteten oder inkorrekt assemblierten Proteinen, erfüllen zusätzlich aber regulatorische Funktionen. Zum Beispiel sind sie verantwortlich für den Abbau von Cyclinen bei der Zellzyklus-Kontrolle und für die Zerstörung von Transkriptionsfaktoren oder metabolischen Enzymen bei der metabolischen Anpassung. Schließlich sind Proteasomen auch in die MHC (major histocompatibility complex) Klasse I vermittelte zelluläre Immunantwort einbezogen. Diese zellulären Funktionen sind mit einem Ubiquitin- und ATP-abhängigen Proteinabbauweg verknüpft, zu dem das 26S Proteasom gehört, dessen proteolytische Grundeinheit vom 20S Proteasom gebildet wird. Das 20S Proteasom hat eine zylindrische Form und besteht aus vier Ringen, die jeweils aus sieben α- oder sieben β- Untereinheiten gebildet und in α β βα Anordnung gestapelt sind. In eukaryontischen Zellen ist das 20S Proteasom aus zwei Sätzen 14 verschiedener Untereinheiten aufgebaut, sieben unterschiedlichen α-Typ und sieben unterschiedlichen β-Typ Untereinheiten. Nur drei der β-Typ Untereinheiten sind proteolytisch aktiv und haben N-terminale Threonin-Reste, die als Nukleophile agieren. Sie unterscheiden sich in ihren wichtigsten Spezifitäten: β5/Pre2, β2/Pup1 und β1/Pre3 werden klassifiziert nach ihrer Chymotrypsin-ähnlichen, Trypsin-ähnlichen􀀀b zw. Peptidylglutamyl-Peptid hydrolysierenden 􀀀( PGPH oder Caspase-ähnlichen) Aktivität. Diese Einteilung basiert auf den bevorzugten Aminosäure-Resten, an denen in Peptid- oder Proteinsubstraten die Hydrolyse stattfindet. Diese drei aktiven β-Typ Untereinheiten haben festgelegte Plätze im Proteasom, wobei die zwei Kopien von β5/Pre2 abgetrennt sind von den nah beieinander liegenden β2/Pup1 und β1/Pre3 Untereinheiten. In der Hefe wurde eine Hierarchie der einzelnen Untereinheiten-Aktivitäten bezüglich der proteasomalen Funktion festgestellt: β5/Pre2 >> β2/Pup1 > β1/Pre3. Ein Teil dieser Arbeit zielt darauf zu klären, ob diese Hierarchie allein von den Spezifitäten abhängt oder ob topologische Bedingungen zu der Dominanz von β5/Pre2 über die anderen führen, was eine über dazwischen liegende inaktive β-Untereinheiten vermittelte Kommunikation unter den Untereinheiten beinhalten könnte. Schrittweise, gerichtete Mutagenese von Resten, welche die Substrat bindenden Taschen ausbilden, wurde benutzt, um die Spezifitäten der aktiven Zentren von β5/Pre2 und β1/Pre3 gegeneinander auszutauschen. Daraufhin wurden die Auswirkungen analysiert, die diese Mutationen bezüglich der Reifung der modifizierten Untereinheiten haben, ihrer Spezifitäten gegenüber für die Chymotrypsin-ähnliche und die PGPH Aktivität diagnostischen Peptid-Substraten und Veränderungen in der Stellung innerhalb der Hierarchie der funktionellen Bedeutung. Nach Mutation des Schlüssel-Rests Methionin 45 zu Arginin war β5/Pre2 in der Lage zu reifen und zeigte etwas PGPH Aktivität. Kombinationen mit Mutantenstämmen, die andere aktive Untereinheiten inaktiviert hatten, zeigten, dass Pre2 seine funktionelle Dominanz verloren hatte. Als zusätzlich weitere Schlüssel-Reste durch jene, die in β1/Pre3 vorliegen, ersetzt wurden (A20T, V31T, I35T), zeigte die β5/Pre2 Untereinheit statt eines weiteren Anstiegs der PGPH Aktivität einen generellen Rückgang von Aktivität. Eine unerwartete Ausnahme war die pre2-M45R-I35T Mutante mit einem starken Anstieg der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität. Nach Mutation des Rests Arginin 45 zu Methionin in Pre3 verlor diese Untereinheit jegliche detektierbare Peptidase-Aktivität. Versuche, Methionin 45 durch Einführung strategischer Punktmutationen am Rest 52 zu stabilisieren, waren erfolglos. Zusätzliche Veränderungen in der Substrat bindenden Region von β1/Pre3 (T20A, T31V, T35I) verhinderten die autolytische Reifung gänzlich und damit die Erlangung jeglicher Aktivität. Stämme, denen sowohl das Propeptid von Pre3 als auch die Nα-Acetyltransferase fehlen, dienten der Bestätigung, dass die Mutationen auch dann zum Aktivitätsverlust führen, wenn die autolytische Entfernung des Propeptids nicht erforderlich ist. In einem zweiten Projekt wurde die Rolle der langen C-terminalen Verlängerung der β2/Pup1 Untereinheit von Hefe untersucht. Diese 37 Aminosäuren lange Struktur umschließt die im β-Ring benachbarte β3/Pup3 Untereinheit und reicht bis zur nächsten Untereinheit, β4/Pre1. Sie hat auch zu β7/Pre6 im gegenüber liegenden Ring Kontakt. Mutationen von Resten, welche den Kontakt zur Oberfläche von β3/Pup3 lockern könnten (Y204A, R208G und T211A), hatten keine Auswirkung. Die komplette Deletion dieser Extension oder die Verkürzung um 25 Reste war letal und die Deletion der letzten 20 Aminosäuren führte zu einem starken Defekt des Zellwachstums. Dieser Phänotyp wurde aufgehoben, wenn die letzten 20 Aminosäuren dieses C-terminalen Anhängsels durch einen FLAG tag ersetzt wurden. Die letalen Mutationen wurden in Wildtyp-Stämmen überexprimiert, jedoch wurden die mutierten β2 Untereinheiten nicht ins Proteasom inkorporiert. Dies deutet darauf hin, dass die Entfernung der distalen Hälfte der C-terminalen Verlängerung von β2/Pup1 den Einbau dieser Untereinheit während früher Assemblierungsstadien des 20S Proteasoms verhindert.