Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6

Abstract

This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.

Diese Doktorarbeit widmet sich der Detektion der häufigsten Spleißvarianten in den Cytochrom P450 Enzymen CYP2D6 und CYP2B6 und der Fragestellung, ob diese mechanistisch bestimmten Punktmutationen zugeordnet werden können. Für die Untersuchung der mRNA-Transkripte in beiden Genen ist ein Mikroarray entwickelt worden, der hoch sensitiv alternative Spleißereignisse detektiert. Der Mikroarray wurde in allen Schritten optimiert, angefangen von der Auswahl der Oligonukleotidsonden, des Herstellungsprozesses der Arrayplattform, dem Umschreiben und Markieren der Target-DNA, den Hybridisierungsbedingungen als auch der Entwicklung einer neuen Auswertemethode, die mit dem gewählten Design der Sonden verwendet werden kann. Es ist bekannt, dass in Allel CYP2D6*41 die Mutation 2988G>A in Intron 6 das Spleißmuster zu einer Transkriptvariante verschiebt, in der Exon 6 fehlt. Der entwickelte Mikroarray für CYP2D6 bestätigte das gehäufte Auftreten dieser alternativen Spleißvariante in Allel CYP2D6*41 und bewies damit seine Funktionalität. Mit Hilfe des CYP2D6-Microarrays wurden zudem allelspezifische Spleißmuster bei den Trägern der häufigsten CYP2D6-Allele *1, *2, *4 und *41, bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass Träger des Allels CYP2D6*41, zusätzlich zu dem bekannten alternativen mRNA-Transkript, in denen Exon 6 fehlt, vermehrt Transkripte besitzen, in welchen Intron 5 und 6 nicht herausgespleißt worden sind. Die Transkriptverteilung in Allel *1 und *2 ist vergleichbar. Beide besitzen fünf Mal mehr des funktionellen Transkriptes (NP), verglichen mit *41. Somit erwiesen sich die entwickelten Spleißarrays als nützliches Werkzeug, um nicht nur Lebergewebe sondern auch allelspezifische Spleißmuster zu detektieren. Durch das spezifische Sondendesign, in Kombination mit gen- bzw. pseudogenspezifischer reverser und linearer Amplifikation, ermöglicht die entwickelte Arrayplattform erstmals, sowohl Gen als auch pseudogenspezifisches Spleißen zu detektieren und zu unterscheiden. Am Beispiel des CYP2B6 Gens konnte gezeigt werden, dass sich die entwickelte Mikroarrayplattform für CYP2D6 und CYP2D7 auch auf andere Gene übertragen lässt. Alternatives Spleißen wurde in CYP2B6 bisher nicht ausführlich untersucht. Das häufige Allel CYP2B6*6 [c.516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] zeigt erniedrigte Proteinexpression in humaner Leber und wurde erst kürzlich mit erhöhtem Efavirenz-Plasmaspiegel in HIV Patienten in Verbindung gebracht. Der molekulare Mechanismus für diese Beobachtungen war bis jetzt ungeklärt. Mit dem entwickelten Spleißarray für CYP2B6 wurde eine neue Spleißvariante gefunden, in der Exon 4 fehlt (SV8) sowie auffallende Transkriptunterschiede beim Vergleich von CYP2B6*6 und *1. Dies führte zu der Idee, dass alternatives Spleißen im Allel *6 eine Rolle spielen könnte. Deswegen wurde RNA aus gut dokumentierten humanen Lebergeweben molekularbiologisch untersucht. Es zeigte sich, dass bisher unbekannte Spleißvarianten (SV8, SV7, SV9) existieren. Das häufigste Transkript in CYP2B6*6 war jedoch nicht das normale mRNA-Transkript (NP) mit allen neun Exons, sondern ein alternatives Transkript, in dem Exon 4 bis 6 fehlt (SV1). SV1 trat in Leberproben mit dem Allel*6 verstärkt auf und war zudem im Zusammenhang mit dem seltenen Allel CYP2B6*3 (c.777C>A) verstärkt nachweisbar. Diese Beobachtungen an humanen Leberproben weisen auf alternatives Spleißen als mögliche Ursache für erniedrigte Genexpression bei varianten CYP2B6 Allelen hin. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-1 und Huh7 Zellen wurden mit Hilfe eines in dieser Arbeit klonierten CYP2B6-Minigenkonstrukt durchgeführt. Mit Hilfe der Minigenkonstrukte zeigte sich deutlich, dass allein der Nukleotidaustausch c.516G>T in Allel CYP2B6*6 verantwortlich ist für das verschobene Spleißmuster zugunsten des Transkripts SV1 und einer verringerten CYP2B6-Expression. Minigenkonstrukte mit dem alleinigen Nukleotidaustausch c.785A>G oder der seltenen Mutation c.777C>A führen dagegen zu normaler bzw. mittlerer Expression des Enzyms CYP2B6. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Mechanismus des häufigen Allels*6 hauptsächlich auf einem prätranslationalen Mechanismus, dem alternativen Spleißen, als Folge einer nicht-synonymen, exonischen Mutation beruht. Diese Arbeit zeigt die Auswirkung von Punktmutationen in Spleißmotiven, als auch die klinische Bedeutung von alternativem Spleißen bei der Aufklärung von medikamentösen Nebenwirkungen wie im Beispiel von Efavirenz in CYP2B6*6-Trägern. Sowohl in CYP2D6 als auch CYP2B6 existiert somit je ein häufiges Allel (CYP2D6*41 bzw. CYP2B6*6), in welchem durch alternatives Spleißen die Menge an funktioneller mRNA und damit Protein und Enzymaktivität verringert wird. Die damit gesicherte Erkenntnis der verursachenden Mutation stellt somit eine sichere Grundlage dar für die Anwendung dieses Polymorphismus in der genetischen Diagnostik sowie der klinischen Praxis.