Untersuchungen von Struktur-Funktions-Beziehungen an Membranproteinen mittels Molekulardynamik-Simulationen

Abstract

Die Molekulardynamik (MD)-Simulation hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer wichtigen und erfolgreichen Methode zur theoretischen Untersuchung biologischer Systeme entwickelt. In dieser Zeit vollzog sich auf dabei eine rasante Entwicklung, die durch den Fortschritt auf dem Gebiet der Entwicklung von Kraftfeldfunktionen, durch die ständig wachsende Anzahl an verfügbaren, hochaufgelösten Strukturdaten von Biomolekülen sowie durch die fortwährend steigende Rechenleistung maßgeblich beeinflusst wurde. Die Hauptanwendung heutiger MD-Simulationen ist die Beschreibung der Dynamik und der Funktion von Proteinen und Proteinkomplexen auf mikroskopischer Ebene, um damit einen detaillierten Einblick in die in der Zelle ablaufenden Prozesse zu erhalten. Hierbei kann die Methode der MD-Simulation einen wichtigen Beitrag leisten, da sie ein atomistisches Bild der Dynamik von Proteinen liefert; eine Eigenschaft, die bislang von keiner experimentellen Untersuchungsmethode erbracht wird. Viele biologische Prozesse laufen auf Zeitskalen ab, die mit heute verfügbaren Rechenressourcen und der konventionellen MD-Simulation noch nicht erreicht werden können. Es existiert eine Reihe von MD-Simulationstechniken (z. B. Umbrella Sampling, Essential Dynamics oder Steered Molecular Dynamics), die es erlauben, diese Prozesse auf berechenbare Zeitskalen zu beschleunigen. In Kombination mit statistischen Analyseverfahren wie beispielsweise der Weighted Histogram Analysis Method oder Fluktuationstheoremen können biologische Prozesse quantitativ untersucht werden. Hierzu hat insbesondere das von Jarzynski im Jahr 1991 entdeckte integrale Fluktuationstheorem beigetragen. Es verknüpft die Änderung der Freien Energie mit einer exponentiellen Mittelung von Arbeitswerten eines beliebig ins Nichtgleichgewicht getriebenen Prozesses. In dieser Arbeit werden drei unterschiedliche biologische Systeme vorgestellt, die mit Hilfe von MD-Simulationen untersucht wurden. Dabei stand die Verknüpfung von strukturellen Eigenschaften der Proteine bzw. Proteinkomplexe mit ihrer Funktionalität im Mittelpunkt. Nach einer Einführung in die theoretischen Grundlagen werden in Kapitel 3 Simulationen am Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1) präsentiert. TNFR1 ist ein Membranrezeptor, der eine wichtige Rolle in der Tumornekrosefaktor-vermittelten Apoptose spielt. Anhand der Simulationsdaten der extrazellulären Domäne des TNFR1 und der daraus abgeleiteten Deletionsmutanten wird eine Bewertung der strukturellen Stabilität vorgenommen. Zusammen mit den Daten einer experimentellen Studie von Marcus Branschädel vom Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart wird die Frage beantwortet, wie sich die strukturellen Veränderungen der Deletionsmutanten von TNFR1 auf die Funktionalität, insbesondere auf mögliche Rezeptor-Rezeptor- und Rezeptor-Ligandenbindung auswirkt. Kapitel 4 beschäftigt sich mit dem Lichtsammelkomplex LH1 und dem Reaktionszentrum (RC) der photosynthetischen Einheit aus dem Purpurbakterium Rhodospirillum rubrum. Eingebaut in die Membran, sind sie für die Absorption von Licht sowie für die Erzeugung von Ladungsträgern in der bakteriellen Photosynthese verantwortlich. Die Ladungsträger werden mit Hilfe des Elektronencarriers Ubichinon zu weiteren Pigment-Proteinkomplexen befördert. Der Weg zum benachbarten Cytochrom-bc1-Komplex führt vom RC, das sich im Inneren des LH1-Rings befindet, in den Membranbereich außerhalb des LH1-Rings. Experimentelle Daten zeigen, dass der LH1-Ring aus dieser Spezies eine geschlossene Struktur um das RC bildet. Es stellt sich somit die Frage, wie das Ubichinon diese Proteinbarriere überwinden kann. Mit Hilfe von MD-Simulationen wird ein möglicher Pfad des Ubichinons durch den LH1-Ring aufgezeigt und eine Zeit abgeschätzt, auf der eine Diffusion durch den geschlossenen LH1-Ring möglich ist. In Kapitel 5 wird der Proteintranslokationskanal SecY aus dem Archaebakterium Methanococcus jannaschii vorgestellt. Der Proteinkanal ist für die Translokation von Proteinen durch bzw. für deren Einbau in die Membran verantwortlich. Wird kein Protein transloziert, muss der Kanal die Membran gegenüber kleinen Molekülen abdichten. Zwei wichtige Strukturelemente, die Pore und der Pfropfen, sind für diese Funktionen von besonderer Bedeutung. Anhand von MD-Simulationen an einer nicht-translozierenden, sowie einer translozierenden Konformation des Proteinkanals werden Unterschiede im Abdichtungsverhalten, der Relaxation, sowie der Bindung des Pfropfens an die Pore untersucht. Es wird gezeigt, dass eine Konformationsänderung in die translozierende Form notwendig ist, um Proteintranslokation zu ermöglichen.

Molecular Dynamics (MD) simulations of biomolecules have come a long way since Karplus et al. performed the first protein simulation in 1977. Steady progress in describing the interactions between the participating atoms along with an ever increasing number of available high resolution structures of proteins and other biomolecules have helped to establish MD-simulation as a powerful tool for studying biological systems. This rapid progress only became possible through an exponential increase in computation power (Moore's law) together with the development of efficient simulation algorithms. The major advantage of a MD-simulation is obvious, since it allows capturing protein dynamics with atomic spatial resolution, therefore delivering a microscopic picture of the biological process under investigation. This is done by numerically integrating Newton's equation of motion, resulting in a trajectory r(t) for every atom in the system. Nowadays, system sizes of up to 105 atoms are routinely investigated on the nanosecond timescale - some simulations have even gone far beyond these limits with respect to system size (1000000) as well as timescale (500 µs). The main field of application of MD-simulations is the microscopic description of the dynamics and function of biomolecules and thus, the construction of a detailed picture of the relevant processes taking place inside the cell. Many biological processes take place on timescales, which are still not accessible by conventional MD-simulations. A number of special simulation techniques, like Umbrella Sampling, Essential Dynamics or Steered Molecular Dynamics (SMD) have emerged that can accelerate the process under investigation onto accessible timescales. One common feature of these methods is an enforced movement of the system along a specified reaction coordinate in order to overcome potential barriers. This is done by applying an additional force or adding a harmonic potential to manipulate one or more atoms of the simulated system. Using statistical analysis methods like fluctuation theorems allows the quantitative study of the accelerated processes. In 1997, Jarzynski formulated an integral version of the fluctuation theorem, connecting the free energy difference to an exponential average of the external work for systems driven arbitrarily out of equilibrium. For infinite sampling of work values, the free-energy estimate is exact; for finite sampling, it allows an estimate of this value. This remarkable equation has since been tested in many experimental investigations as well as simulation studies. In the framework of this thesis, three different biological systems are investigated using MD-simulations. The main focus lies on the identification between structural features that are related to functional consequences. After outlining the theoretical background, chapter 3 deals with the tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1). This integral membrane protein plays an important role in tumor necrosis induced apoptosis. Using data from MD-simulations of the extracellular domain and deletion mutants derived thereof, the structural stability of the investigated systems is analyzed. In combination with data from an experimental study of Marcus Branschädel from the "Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart" the question is answered how structural differences of the deletion mutants are linked to functional consequences of the receptor, in particular alterations of receptor-receptor and receptor-ligand interactions. In chapter 4 MD-simulations of the light harvesting complex LH1 and the reaction center (RC) of the photosynthetic unit of the purple bacterium Rhodospirillum rubrum are presented. Integrated into the membrane, these two pigment protein complexes are responsible for both light absorption and for the generation of charge carriers in bacterial photosynthesis. The charges are then transported to subsequent pigment protein comlexes by a carrier molecule called quinone. Experimental data show that LH1 from this species has a closed ring structure. The question arises how the quinone molecule can overcome this structural barrier. MD-simulations are used to find a pathway through the LH1 ring and to estimate a possible diffusion time for the quinone to move through the closed ring structure. In chapter 5 the protein conducting channel SecY from the archaeal bacteria Methanococcus jannaschii is introduced. The protein channel is responsible for translocating proteins across as well as integrating proteins into the membrane while in the inactive, non translocating state it has to seal the membrane. Two main structural features, the pore and the plug are important for the correct functionality of the protein channel. Using data from MD-simulations of both a translocating as well as a non-translocationg form of SecY, differences in the sealing behaviour, the relaxation dynamics as well as the binding strength of the plug are revealed.