Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans

Abstract

Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.

Candida albicans is a common human pathogen which may cause superficial and systemic infections especially in persons with weakened immune system. During infection, the cell wall and its components plays an important role because this complex network built of glucan, chitin, mannan and proteins is the interface between host and pathogen. It was shown that several of the embedded proteins are crucial for adhesion and interaction with the host. During yeast to hyphal transition significant changes in the cell wall proteome were first suggested by microarray experiments and further confirmed by studies focusing on cell wall proteomics. In this work, the effects of different sample preparations for solubilisation of covalently bound proteins or peptides thereof from isolated cell walls for identification with MS/MS were compared. Trypsin, endoproteinase Glu-C and cyanogene bromide alone or in combination were used for protein fragmentation, and the effects of a pre-treatment of the cell wall with a β-1,3-glucanase tested and compared to each other. Two different types of mass spectrometers were used for identification of the peptides. Overall, 33 proteins were identified in yeast growth form, 6 with a predicted GPI-anchor. In contrast, 14 of the identified 18 proteins in hyphal cells carry this specific anchor sequence. Based on the level of transcripts, 12 of these proteins are up regulated under hyphal inducing conditions. A large variance in the identification of proteins and the number of peptides corresponding to one protein depending on the method used was found. Additionally, proteins secreted from C. albicans growing in liquid synthetic media were identified. Among these proteins, Sun41p was found to be secreted to the media of cells growing as blastospores as well as hyphae. The transcription of this protein was found to be up regulated in hyphae in previous work. The SUN gene family, it belongs to, has been defined in S. cerevisiae and comprises a fungal specific family of proteins which show high similarity in their C-terminal domain. Genes of this family are involved in different cellular processes like DNA replication, ageing, mitochondrial biogenesis and cytokinesis. In C. albicans the SUN-family comprises two genes, SUN41 and SIM1. Being of interest as potential virulence factor and therefore potential target in an anti-fungal therapy, the function of Sun41p was examined by construction of a SUN41 deletion mutant. Using this, it could be demonstrated that C. albicans mutants lacking SUN41 show similar defects as found for S. cerevisiae including defects in cytokinesis. In addition, the SUN41 mutant showed a higher sensitivity towards the cell wall disturbing agent Congo red, whereas no difference was observed in the presence of Calcofluor white. Compared to the wild type SUN41 deletion strains exhibited a defect in biofilm formation, a reduced adherence on epithelial tissue models and are unable to form hyphae on solid media under the conditions tested. The results support a function of Sun41p as glycosidase involved cell wall biogenesis affecting cytokinesis, adhesion to host tissue, biofilm formation and virulence indicating an important role in host-pathogen interaction.