Molekularbiologische und prozesstechnische Optimierung der P450BM-3 basierten Ganzzellbiotransformation von alpha-Pinen im wässrig-organischen Zweiphasenprozess

Abstract

Im Zentrum dieser Arbeit stand die Entwicklung eines wässrig-organischen Zweiphasenpro-zesses zur regio- und stereoselektiven Ganzzellbiotransformation eines apolaren und toxischen Terpens zu hochwertigen Produkten. Die Fünffachvariante V26T R47F A74G F87V L188K der katalytisch unabhängigen P450-Monooxygenase CYP102A1 (P450BM 3 QM) und das bizyklische Monoterpen (-)-alpha-Pinen wurden als Modellenzym bzw. –terpen verwendet, um die mikrobielle Ganzzellbiotransformation durch rekombinante Escherichia coli BL21 (DE3) Zellen zu untersuchen. Dabei konnten Produktausbeuten und Produktend-konzentrationen des wässrig-organischer Zweiphasenbioprozess sowohl durch prozesstechni-sche als auch molekularbiologische Optimierungen verbessert werden. P450BM 3 QM oxidiert in einer cofaktorabhängigen Reaktion (-)-alpha-Pinen zu (-)-alpha-Pinenoxid, (-)trans-Verbenol und (-)-Myrtenol mit einem Enantiomerenüberschuß >92%. Verbenol und Myrtenol fördern die Entkopplung der NADPH-Oxidation von der Substratoxidation und hemmen dadurch P450BM 3 QM kompetitiv. Zusätzlich zu diesem Phänomen machte die Instabilität von alpha-Pinenoxid in wässriger Lösung eine interne in situ Produktabtrennung durch Extraktion in eine organische Trägerphase, die im direkten Kontakt mit dem Ganzzellbiokata-lysator steht und gleichzeitig als Substratreservoir dient, notwendig. Im Erlenmeyerkolben mit reinem (-)-alpha-Pinen als organische Phase konnten einige prozessrele-vante Parameter, wie toxische Einflüsse einer alpha-Pinenphase auf E. coli, identifiziert werden. Durch Expression eines Glucosefacilitators (GLF) aus Zymomonas mobilis und einer Glucosedehydrogenase (GlcDH) aus Bacillus megaterium konnte ein, auf extrazellulär vorliegender Glucose basierendes, intrazelluläres Cofaktorregenerationssystem eingeführt werden und dessen positiver Einfluss auf die spezifische Produktausbeute YP/X und die spezifische initiale Produktbildungsrate Q beschrieben werden. Bei Verwendung eines Ganzzellbiokatalysators mit rekombinanter Cofaktorregenerierung konnte YP/X um das Sechs- und Q um das Neunfache gesteigert werden. Bei der prozesstechnischen Optimierung des Zweiphasenbioprozesses konnte, durch Einführung von Diisononylphthalat (DINP) als organische Trägerphase für das Substrat alpha-Pinen, eine Verbesserung der Biokompatibilität der organischen Phase und dadurch eine Verlängerung des Produktbildungszeitraums auf über 4 h erreicht werden. Weitere prozessrelevante Parameter wie Rührerdrehzahl, Volumen der organischen Phase und Anteil des Substrats alpha-Pinen in der organischen Phase wurden identifiziert und optimiert. Die Kombination prozesstechnischer und molekularbiologischer Optimierungen führte zu bisher in der Literatur nicht beschriebenen Konzentrationen für die biokatalytische Oxidation von alpha-Pinen von über 1 g l 1 oxidierte Produkte bezogen auf das Volumen der wässrigen Phase nach 4 h Biotransformationszeit. Diese Produktausbeuten stellen einen weiteren Schritt zur Etablierung industrieller Verfahren zur biologischen Wertschöpfung auf Basis von Terpenen dar.

A recombinant E. coli BL21 (DE3) strain overexpressing a variant of P450BM-3 (V26T/R47F/A74G/F87V/L188K) oxyfunctionalizes the bicyclic monoterpene alpha-pinene to alpha-pinene oxide, verbenol and myrtenol. To address the low water solubility and the toxicity of terpenoids an aqueous-organic two-phase bioprocess was developed. Diisononyl phthalate (DINP) was selected as a biocompatible organic carrier solvent capable of masking the toxic effects mediated by alpha-pinene and of efficiently extracting the products enabling scale-up to the bioreactor. With an aqueous to organic phase ratio of 3:2 and 30 % (v/v) of alpha-pinene in the organic phase a biocatalytic product formation period of more than 4 hours was achieved. A comparison of the biotransformation performance of BL21 (P450BM 3 QM) and a strain with an additional heterologous NADPH regeneration system comprising glucose facilitator and dehydrogenase, but only expressing half the amount of P450BM-3 QM, shows comparable product concentrations of 1020±144 and 800±61 mg l-1Aq, respectively. The total product yields YP/P450 (µmol µmol 1P450) were 80 % higher when the strain with the cofactor regeneration system was used. A total product concentration of over 1 g lAq-1, corresponding to the highest value reported for microbial alpha-pinene oxyfunctionalization so far, marks a promising step forward towards a future application of recombinant microorganisms for the selective oxidation of terpenoids to value-added products.