Characterization of Candida albicans genes involved in cell wall biogenesis and infection

Abstract

Candida albicans is a commensal organism living on skin and mucosal surfaces of humans and warm blooded animals. Its presence becomes a problem in immunocompromised patients where it may turn into an opportunistic pathogen. Candida colonizes various host niches including skin, gastrointestinal and the urogenital tract, which offer various environments in terms of pH and nutrient availability. The cell surface of the fungus is the site of direct interaction of Candida with the host, mediating environmental sensing, adhesion and also interaction with the host immune system. Since the cell wall is not present in humans its components are a prime target for drug development. One part of this work is focused on characterization of cell wall changes induced by deletion of genes efg1 and cph1. These genes encoding for transcription factors were previously described to be involved in many cellular functions including filamentation and pathogenicity. Deletion of efg1 affects mostly the glucan polysaccharide part of the fungal cell wall. In contact with macrophages and dendritic cells, deletion of efg1 itself or together with cph1 alters significantly the immunogenicity of the strains, while deletion of cph1 alone plays only a minor role. In order to reveal whether C. albicans is able to specifically respond to different host niches, transcriptional profiling was used in order to identify C. albicans genes differentially regulated during adhesion on polystyrene, vaginal and intestinal tissue models. The second part of this work is following up on the results of the transcriptional profiling. It is focused on functional characterization of several genes differentially regulated under the tested conditions and encoding for putative cell surface proteins. Among the genes characterized in detail are two encoding for predicted GPI-proteins, Pga7 and Pga23 and one for a protein secreted to the medium, Pra1. Functional studies of PGA7, PGA23 and PRA1 with regard to adhesion and invasion as well as cell wall structure and stability were performed using deletion and overexpression strains. These studies qualify Pga7, Pga23 and Pra1 as structural elements of the cell wall rather than adhesins. The proper function of Pra1 seems to be also in interaction with host components. Finally, a family of genes with one member induced during adhesion (AUF8 Adhesion Upregulated Factor 8) was analyzed. These genes were predicted to be localized in the plasma membrane, carrying four transmembrane domains. There are totally seven homologues in the C. albicans genome including AUF8, and of which six are located on chromosome 5 in a 10 kb gene-cluster. When heterologously expressed in S. cerevisiae, one of the proteins, Auf8GFP localizes to the plasma membrane. Deletion studies did not show any direct involvement of the AUF genes in the adhesion or invasion process. However, there are some indications about their importance during stationary phase of growth.

Candida albicans ist ein kommensaler Mikroorganismus, der auf der Haut und Schleimhaut von Menschen und warmblütigen Tieren lebt. Problematisch wird seine Anwesenheit bei immunsupprimierten Patienten, bei denen sich C. albicans zu einem opportunistischen Pathogen wandeln kann. Im Wirt besiedelt Candida unterschiedliche Nischen, darunter die Haut, den Gastrointestinaltrakt sowie den Urogenitaltrakt. Diese bieten somit verschiedenartige Milieus bezüglich pH-Wert und die Verfügbarkeit von Nährstoffen. Die direkte Interaktion zwischen Candida und dem Wirt erfolgt über die Zelloberfläche des Pilzes, wodurch die Wahrnehmung der Umgebungsbedingung, die Adhäsion und auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts vermittelt werden. Da menschliche Zellen keine Zellwand aufweisen, sind deren Bausteine die wichtigsten Ziele für die Entwicklung von Medikamenten. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von Veränderungen der Zellwand, die durch die Deletion der Gene efg1 und cph1 induziert werden. Wie bereits beschrieben, sind diese Gene, die für Transkriptionsfaktoren kodieren, an vielen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Ausbildung von Filamenten und von Pathogenität. Eine Deletion von efg1 beeinflusst hauptsächlich den Glukan-Polysaccharid-Anteil der Zellwand des Pilzes. Bei Kontakt mit Makrophagen und Dendritischen Zellen verändert eine Deletion von efg1 allein oder in Kombination mit cph1 die Immunogenität der Stämme signifikant, wohingegen die alleinige Deletion von cph1 eine untergeordnete Rolle spielt. Um herauszufinden, ob C. albicans in der Lage ist spezifisch auf die unterschiedlichen Nischen im Wirt zu reagieren, wurden Transkriptionsprofile erstellt zur Identifizierung von C. albicans Genen, die während der Adhäsion auf Polystyren sowie auf vaginalen und intestinalen Gewebemodellen differentiell reguliert werden. Der zweite Teil der Arbeit baut auf den Ergebnissen dieser Transkriptionsprofile auf. Der Fokus liegt dabei auf der funktionalen Charakterisierung mehrerer, unter den getesteten Bedingungen differentiell regulierter Gene, die für putative Zelloberflächenproteine kodieren. Unter den im Detail charakterisierten Genen befanden sich zwei codierende Gene für potentielle GPI-Proteine, Pga7 und Pga23 sowie eine für ein Protein, Pra1, das ins Medium sekretiert wird. Funktionale Studien von PGA7, PGA23 und PRA1 bezüglich Adhäsion und Invasion sowie Zellwandstruktur und Stabilität wurden mittels Deletions- und Überexpressionsstämmen durchgeführt. Diese Studien qualifizieren Pga7, Pga23 und Pra1 eher als strukturelle Elemente der Zellwand als Adhäsine. Die eigentliche Funktion von Pra1 scheint auch in der Interaktion mit Wirtskomponenten zu liegen. Abschließend wurde eine Genfamilie analysiert, von denen ein Mitglied (AUF8 Adhesion Upregulated Factor 8) während der Adhäsion hochreguliert wird. Diese enthalten vier Transmembrandomänen und sind voraussichtlich in der Plasmamembran lokalisiert. Es konnten sieben homologe Gene im Genom von C. albicans identifiziert werden, von denen sich sechs auf dem Chromosom 5 in einem 10 kb-Gencluster befinden. Während der heterologen Genexpression als GFP-Fusionsprotein in Saccharomyces cerevisiae ist das Protein Auf8-GFP an der Plasmamembran lokalisiert. Deletionsstudien zeigten keinen direkten Einfluss der AUF-Gene auf den Adhäsions- oder Invasionsprozess. Allerdings gibt es Anzeichen für die Bedeutung dieser Gene während der stationären Wachstumsphase.