Konstruktion von Escherichia coli Produktionsstämmen zur fermentativen Herstellung von Succinat aus Glycerin

Abstract

Glycerin fällt in großen Mengen bei der Biodieselproduktion an und kann als billiger, nachwachsender Rohstoff betrachtet werden, aus dem sich biotechnologisch viele industriell relevante Fein- oder Bulkchemikalien herstellen lassen. Eine der Bulkchemikalien ist Succinat, das Anion der Bernsteinsäure, welche in Studien des Department of Energy der USA (DOE) in den Jahren 2004 und 2010 als wichtige Plattformchemikalie bezeichnet wurde. Plattformchemikalien bzw. chemische Bausteine können kostengünstig in eine Vielzahl von weiteren, höherpreisigen Materialien umgewandelt werden. In dieser Arbeit wurden Escherichia coli Produktionsstämme für Succinat konstruiert. Die Bildung größerer Zellmassen erfolgte vor der Produktionsphase in einer aeroben Wachstumsphase in Minimalmedium mit Glycerin als C-Quelle. In der mikroaeroben oder anaeroben Produktionsphase wurde dann wachstumsentkoppelt Succinat aus Glycerin und Kohlenstoffdioxid bzw. Hydrogencarbonat gebildet. Die Entstehung von 1 mol Succinat aus 1 mol Glycerin unter Fixierung von 1 mol CO2 ist redoxneutral und stellt die theoretisch maximale Succinatausbeute dar. Zuerst wurde eine Methode entwickelt, um die Succinatproduktion verschiedener Stämme schnell und einfach miteinander vergleichen zu können. Diese Biotransformationen im Kleinmaßstab wurden in 1,5 ml Plastikgefäßen durchgeführt. Zuvor wurden diese mit 1,2 ml einer Zellsuspension von 0,5 OD600/ml in M9-Minimalmedium gefüllt, welches definierte Mengen Glycerin und Hydrogencarbonat enthielt. Anschließend wurde der zeitliche Verlauf der Zelldichte und der exkretierten Metabolite gemessen. Nach einem anfänglichen, kleinen Anstieg der Zelldichte auf durchschnittlich 0,7 OD600/ml blieb diese während des Produktionszeitraumes bis zu 15 Tage konstant. In einem Experiment wurde der Einbau von 13C-markiertem Hydrogencarbonat in das gebildete Succinat per Massenspektrometrie bestätigt. Verschiedene Stoffwechselwege führen zum Succinat. Aus diesen Wegen wurden drei Strategien zur Succinatproduktion abgeleitet, wobei jede Strategie eine Kombination mehrerer Wege beinhaltete. Der metabolische Fluß über bestimmte Wege wurde durch die Deletion von Genen mit der λRed-Rekombinationsmethode oder durch Plasmid-basierte Expression von Genen, die für auf den jeweiligen Routen benötigte Enzyme codieren, begünstigt. Außerdem sollten die Deletionen die Entstehung von Nebenprodukten wie beispielsweise Acetat verhindern. Nach der ersten Strategie sollte Succinat durch PEP-Carboxylierung und über den Glyoxylatzyklus produziert werden. Dem Stamm ss328 (ΔackA-pta ΔmgsA ΔgldA ΔtdcE ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) fehlt der Großteil der Pyruvat-verbrauchenden Enzyme. Zusätzlich wurde die Acetatentstehung verhindert. Stamm ss328 verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 43,2 ± 5,7 mM Glycerin und bildete 28,1 ± 3,3 mM Succinat. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 65,1 ± 1,4 %. Nach der zweiten Strategie sollte Succinat neben PEP-Carboxylierung vor allem durch Pyruvat-Carboxylierung gebildet werden. Stamm ss331 (ΔlipA ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) kann viele Pyruvat-verbrauchende Enzyme nicht mehr synthetisieren. Außerdem ist wegen ΔlipA der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex inaktiv, falls keine Liponsäure zugegeben wird. ss331 wurde mit Plasmid pSS84.4 transformiert, welches das Gen für das Malic-Enzym 2 von Arabidopsis thaliana trug. Der resultierende Stamm verbrauchte bei einer Biotransformation mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 37,6 ± 1,4 mM Glycerin und bildete 26,6 ± 0,7 mM Succinat. Dies kam einer molaren Succinatausbeute von 70,9 ± 0,7 % gleich. Nach der dritten Strategie sollte Succinat ausschließlich durch PEP-Carboxylierung entstehen, weswegen die Gene pykA und pykF, die für Pyruvatkinasen codieren, deletiert wurden. Die Pyruvatkinasen katalysieren die direkte Umwandlung von PEP in Pyruvat. Die erhaltenen Stämme konnten auf Glycerin kaum wachsen, da sie nur ungenügende Mengen Pyruvat bilden konnten. Erst nach einer Selektion auf schnelleres Wachstum in Minimalmedium mit Glycerin zeigten die erhaltenen Mutanten Wachstumsraten im Bereich von 0,3 h-1. Pyruvat wurde in diesen Stämmen vermutlich verstärkt über die POMP-Umleitung gebildet, welche folgende Schritte beinhaltet: PEP-Carboxylierung zum Oxalacetat, Umwandlung von Oxalacetat in Malat und Decarboxylierung von Malat zum Pyruvat. Mit dem Stamm ss279 (ΔgldA ΔtdcE ΔpykA ΔpykF ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) wurde in Biotransformationen mit 0,5 OD600/ml Zellen innerhalb von 6 Tagen 57,8 ± 2,8 mM Glycerin verbraucht und 47,1 ± 1,1 mM Succinat gebildet. Dies entsprach einer molaren Succinatausbeute von 81,5 ± 2,0 %. Berücksichtigt man nur den reinen Produktionszeitraum ohne Zellmassebildung ab dem zweiten Tag, so wurden noch höhere Ausbeuten von 89,5 ± 3,7 % erhalten.

Glycerol is produced in large quantities in the process of biodiesel production. It is a cheap, renewable resource that can be biotechnologically transformed into many industrially relevant fine or bulk chemicals. One such bulk chemical is succinate, the anion of succinic acid, which was described in studies of the U.S. Department of Energy (DOE) in 2004 and 2010 as an important platform chemical. Platform chemicals or chemical building blocks can be economically converted into a variety of other, higher-priced materials. In this work succinate production strains of Escherichia coli were constructed. The generation of substantial cell mass occurred prior to the production phase during an aerobic growth phase in minimal medium with glycerol as sole carbon source. In the following microaerobic or anaerobic production phase succinate was produced from glycerol and carbon dioxide or bicarbonate under non-growth conditions. The formation of 1 mol of succinate from 1 mol of glycerol with concomitant fixation of 1 mol of CO2 is redox neutral, and represents the theoretical maximum yield. First, a protocol was developed to compare the succinate production of different strains easily and quickly. 1.5 ml plastic vials were used for this small-scale biotransformation assay. They were filled beforehand with 1.2 ml cell suspension of 0.5 OD600/ml in M9 minimal medium, which contained defined amounts of glycerol and bicarbonate. Then the time course of cell density and excreted metabolites was analyzed. After an initial, small increase in cell density to 0.7 OD600/ml on average it remained constant up to 15 days during the the production period. In one experiment, the incorporation of 13C-labeled bicarbonate into the produced succinate was confirmed by mass spectrometry. Several metabolic pathways lead to succinate. Three strategies for the production of succinic acid were derived from these pathways. Each strategy is comprised of a combination of several routes. The metabolic flux through the desired routes was favored by deletion of genes of competing pathways with the λRed-recombination method or by plasmid-based expression of genes that code for enzymes needed for the particular route. In addition, the deletions prevented the formation of by-products such as acetate. Production strains following the first strategy should produce succinate by PEP carboxylation and the glyoxylate shunt. Strain ss328 (ΔackA-pta ΔmgsA ΔgldA ΔtdcE ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) amongst others lacks the majority of pyruvate-consuming enzymes. Moreover the formation of acetate was prevented. It consumed 43.2 ± 5.7 mM glycerol and produced 28.1 ± 3.3 mM succinate during a biotransformation with 0.5 OD600/ml cells within 6 days. This corresponded to a molar yield of 65.1 ± 1.4 %. Strains that were constructed according to the second strategy could form succinate by PEP carboxylation and especially by pyruvate carboxylation. The strain ss331 (ΔlipA ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) lacks many of the pyruvate-consuming enzymes. In addition, the pyruvate dehydrogenase complex is inactive if no lipoic acid is added to the medium. Strain ss331 transformed with plasmid pSS84.4 carrying the malic enzyme 2 from Arabidopsis thaliana was used in a biotransformation with 0.5 OD600/ml cells. Within 6 days 37.6 ± 1.4 mM glycerol was used and 26.6 ± 0.7 mM succinate was formed. This represented a molar yield of 70.9 ± 0.7 %. The third strategy involved succinic acid production exclusively by PEP carboxylation, which is why the genes pykF and pykA, encoding pyruvate kinases have been deleted. The pyruvate kinases catalyze the direct conversion of PEP into pyruvate. The resulting strains could barely grow on glycerol. Only after a selection for faster growth in minimal medium with glycerol, the resulting mutants showed growth rates on glycerol in the range of 0.3 h-1. Pyruvate was formed in these strains through the POMP-pathway, a local rerouting of metabolism which includes the following steps: PEP carboxylation to oxaloacetate, conversion of oxaloacetate to malate, and decarboxylation of malate to pyruvate. Strain ss279 (ΔgldA ΔtdcE ΔpykA ΔpykF ΔldhA ΔpoxB ΔpflB) was used in biotransformations with 0.5 OD600/ml cells. In 6 days 57.8 ± 2.8 mM glycerol was consumed and 47.1 ± 1.1 mM succinate was produced. This corresponded to a molar yield of 81.5 ± 2.0 %. When only the production period from the second day on is considered an even higher yield of 89.5 ± 3.7 % was obtained.