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Autor(en): Randel, Nadine
Titel: Biologische Untersuchungen zum „lower acyclic terpene utilisation (atu) pathway“ in Pseudomonas aeruginosa und chemische Synthese wichtiger Intermediate dieses Stoffwechselweges
Sonstige Titel: Biological investigations on the "lower acyclic terpene utilization (atu) pathway" in Pseudomonas aeruginosa and chemical synthesis of important intermediates of this pathway
Erscheinungsdatum: 2012
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-77722
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/2037
http://dx.doi.org/10.18419/opus-2020
Zusammenfassung: Der Abbau von Citronellol und verwandten azyklischen Terpenoiden ist aufgrund einer Methylgruppe in beta-Position schwierig und nicht weit verbreitet. Die Organismen P. aeruginosa und P. citronellolis umgehen die Blockierung der beta-Oxidation durch Carboxylierung dieser Methylgruppe auf Stufe des CoenzymA-Esters 19 (Geranyl-CoA). Durch Wasseranlagerung an die Doppelbindung wird die Voraussetzung für die Abspaltung der Acetat-Funktionalität geschaffen, wobei die resultierende Verbindung 23 (7-Methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA) folgend weiter über beta-Oxidation abgebaut werden kann. •In Rohextrakten von Citronellsäure (Cs)-gewachsenen P. aeruginosa PAO1 Zellen wurde eine spezifische Geranyl-CoA Carboxylase (GCase) Aktivität von 11 ± 6 mU/mg und eine spezifische Methylcrotonyl-CoA Carboxylase (MCase) Aktivität von 47 ± 11 mU/mg bestimmt. Rohextrakte von Isovaleriansäure (Iso)-gewachsenen Zellen enthielten 54 ± 22 mU/mg MCase Aktivität. •Eine über Avidin-Chromatographie gereinigte Präparation an Biotin-Carboxylasen wies MCase Aktivität in Höhe von 4600 ± 966 mU/mg (Iso-Zellen) bzw. von 1900 ± 1200 mU/mg (Cs-Zellen) auf. GCase Aktivität konnte nicht nachgewiesen werden. •Die Untereinheiten der MCase und GCase wurden rekombinant in E. coli synthetisiert und partiell gereinigt. Eine Bestimmung der Aktivität mit den selbsthergestellten CoA-Substraten konnte aber nur mit MCoA für die MCase erfolgen (2700 ± 126 mU/mg). Mit der rekombinanten GCase und GCoA 19 bzw. MCoA 29 konnte dagegen keine Aktivität bestimmt werden. •Neben den Carboxylasen wurden auch AtuD, AtuE und AtuA rekombinant exprimiert und als His-Tag Fusionsproteine aus E. coli Rohextrakten gereinigt. •Für AtuD konnte Citronellyl-CoA Dehydrogenase Aktivität sowohl über einen optischen Enzymassay (464 ± 9,9 mU/mg) als auch über den Nachweis des Reaktionsproduktes mittels HPLC-(ESI)-MS gezeigt werden. Eine Isolierung des so bereitgestellten cis-Geranyl-CoAs 19a aus dem Reaktionsansatz war jedoch nicht möglich. Auch eine Kopplung des Assays mit dem Carboxylase Assay und somit ein möglicher direkter Umsatz des gebildeten cis-GCoAs 19a über die Geranyl-CoA Carboxylase war nicht erfolgreich. •Die gereinigten rekombinanten Proteine AtuE (IHG-CoA Hydratase) und AtuA (mögliche HHG-CoA Lyase) wurden in erste Kristallisationsversuche eingesetzt. Für AtuE konnte kürzlich die Struktur mit 2,3 Å Auflösung gelöst werden. Der geplanten biochemischen Analyse beider Enzyme stand die Nichtverfügbarkeit der entsprechenden Substrate Isohexenyl-glutaconyl-CoA (IHG-CoA, 20) und 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) entgegen. Der Versuch das Substrat der Hydratase enzymatisch über die Reaktion der vorangestellten GCase zu generieren scheiterte. Im Verlauf der chemischen Arbeiten gelang es allerdings eine Vorstufe des AtuE-Substrates 94 darzustellen. Der notwendige CoA-Ester 20 wurde synthetisiert. Eine Aktivität von nativem und rekombinantem AtuE als Hydratase konnte allerdings noch nicht gezeigt werden. Eine Funktion von AtuA als vermutliche HHG-CoA Lyase konnte in dieser Arbeit aufgrund des fehlenden Substrates 21 nicht untersucht werden. •Eine Trennung des cis/trans Isomerengemisches der Geranylsäure 8 war erst nach Überführung dieser in die jeweiligen Methylester 115a bzw. 115b möglich. Beide Methylester können nun als Referenzen für folgende Metabolit-Analysen dienen. Eine Verseifungsreaktion lieferte die isomerenreinen Säuren (8a, 8b) und nach der CoA-Ester Synthese auch cis- und trans-Geranyl-CoA (19a, 19b). •Unter Verwendung des Geranylsäuremethylesters 115 konnte erstmals eine Vorstufe des Hydratase-Substrates 125 in hoher Ausbeute dargestellt werden. Eine Trennung der beiden Doppelbindungsisomere (125a, 125b) gelang über semi-präparative HPLC. Diese Methylester stehen nun ebenfalls als Referenzverbindungen zur Verfügung. Durch Verseifung konnte die racemische Dicarbonsäure 94 und nach Synthese des CoA-Esters erstmalig auch das racemische Hydratase-Substrat 20 erhalten werden. Eine mögliche stereospezifische Hydroxylierung durch das Enzym Isohexenyl-glutaconyl-CoA Hydratase (AtuE) konnte nicht untersucht werden, da die hier dargestellten Isomere der Vorstufe (125a, 125b) nicht in die CoA-Ester Synthese eingesetzt werden konnten. •Versuche eine Vorstufe des Hydratase-Produktes/Lyase-Substrates darzustellen, waren nicht erfolgreich, jedoch konnten Daten erhalten werden, welche auf eine Instabilität der Verbindung 104 als eine Vorstufe des HHG-CoAs 21 hindeuten. Dies könnte bedeuten, dass auch das Substrat 21 der Lyase selbst nicht stabil ist und somit in vivo nur als kurzlebiges Intermediat vorliegt. Das 3-Hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) ist für weitere Untersuchungen somit bislang nicht verfügbar. Im Gegensatz dazu gelang es erstmalig eine Vorstufe des Lyase-Produktes darzustellen. Dieser Methylester 133 steht nun ebenfalls als Referenzverbindung für anschließende Untersuchungen zur Verfügung.
The degradation of citronellol and related acyclic terpenoid molecules is difficult due to a methyl group in beta-position and not widely spread. P. aeruginosa and P. citronellolis circumvent the blocking of the beta-oxidation by modifying this methyl group. During the “lower atu pathway” the methyl group of the coenzyme A ester 19 (geranyl-CoA) is first carboxylated. By hydration of the double bound the conditions for the cleavage of the acetate functionality are established. The resulting compound 23 (7-methyl-3-oxo-6-octenoyl-CoA) can then be further degraded by beta-oxidation. •In crude extracts of sodium citronellate (Cs)-grown P. aeruginosa PAO1 cells a specific geranyl-CoA carboxylase (GCase) activity of 11 ± 6 mU/mg and a specific methylcrotonyl-CoA carboxylase (MCase) activity of 47 ± 11 mU/mg was detected. Crude extracts of isovaleric acid (Iso)-grown cells showed MCase activity of 54 ± 22 mU/mg. •A by avidin-chromatography purified preparation of biotin-carboxylases showed MCase activity in an amount of 4600 ± 966 mU/mg (Iso cells) and of 1900 ± 1200 mU/mg (Cs cells). GCase activity could not be detected. •The subunits of the MCase and GCase were synthesized recombinantly in E. coli and partially purified. A determination of the activity of both carboxylases with the self-made CoA-substrates could be done only with MCoA for the MCase (2700 mU/mg ± 126 mU/mg). In contrast with the recombinant GCase and GCoA 19 or MCoA 29 no activity could be determined. •In addition to the carboxylases AtuD, AtuE and AtuA were recombinantly expressed as his-tag fusion proteins and purified from E. coli crude extracts. •For AtuD the citronellyl-CoA dehydrogenase activity could be shown by an optical enzyme assay (464 ± 9,9 mU/mg) and also by detecting the reaction product by HPLC-(ESI)-MS. An isolation of the so provided cis-geranyl-CoA 19a from the reaction mixture was not possible. Also a coupling of the assay with the carboxylase assay, and thus a possible direct turnover of the resulting cis-GCoA 19a by the geranyl-CoA carboxylase was not successful. •The purified recombinant proteins AtuE (isohexenyl-glutaconyl-CoA hydratase) and AtuA (putative 3-hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA:acetate lyase) were used in crystallization experiments. Recently, for AtuE the structure was resolved at 2.3 Å. For AtuA are currently still no usable crystals available. The planned biochemical analysis of both enzymes was finally opposed by the non-availability of the appropriate substrates isohexenyl-glutaconyl-CoA (IHG-CoA, 20) and 3-hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21). The attempt to generate the substrate of the hydratase enzymatically by the reaction of the preceding GCase failed. In the course of the chemical works a precursor of the AtuE substrate 94 was successfully obtained. The necessary CoA ester 20 was synthesised. However, an activity of native and recombinant AtuE as IHG-CoA hydratase could not be shown yet under the chosen conditions. The function of AtuA presumed HHG-CoA lyase could not be studied in this work due to the lack of substrate 21. •A separation of the cis/trans isomers of geranic acid 8 was possible only after the conversion of these into the respective methyl ester 115a and 115a. Both methyl esters can now serve as references for the following metabolite analysis. Saponification resulted in the isomerically pure acids (8a, 8b) and after the CoA ester synthesis the cis and trans geranyl-CoA (19a, 19b) were available. •Using the geranic acid methyl ester 115 a precursor of the hydratase substrate 125 could be shown in high yield for the first time. A separation of the two double bond isomers (125a, 125b) was carried out by semi-preparative HPLC. These methyl esters are now available as reference compounds. Through saponification the racemic dicarboxylic acid 94 and after the synthesis of the CoA ester the racemic hydratase substrate 20 were obtained for the first time. A possible stereospecific hydroxylation by the enzyme isohexenyl-glutaconyl-CoA hydratase (AtuE) couldn´t be investigated, because the shown isomers of the precursor (125a, 125b) couldn´t be used in the CoA ester synthesis. •Attempts to synthesise a precursor of the hydratase product/lyase substrate were made but not successful. Data that indicate an instability of the compound 104 as a precursor of the HHG-CoA 21 were obtained. This could imply that the substrat 21 of the lyase itself is not stable in vivo and thus is present only as a short-lived intermediate. Therefore the 3-hydroxy-3-isohexenyl-glutaryl-CoA (HHG-CoA, 21) is currently not available for further investigations. In contrast a precursor of the lyase product 133 was synthesised for the first time. This methyl ester 133 is now also available as a reference compound for subsequent investigations.
Enthalten in den Sammlungen:04 Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik

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