Identifizierung und Funktionsanalyse neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16

Abstract

Poly(3-hydroxybuttersäure) (PHB) spielt eine wichtige Rolle als Kohlenstoff- und Energiespeicher in zahlreichen Mikroorgansimen. Intrazellulär gebildetes PHB liegt hierbei in Form von so genannten nativen PHB-Granula vor. An der Oberfläche der PHB-Granula sind unter anderem Proteine gebunden, welche für deren Synthese (PHB-Synthase, PhaC) oder Abbau (PHB-Depolymerase, PhaZ) verantwortlich sind oder das Oberfläche/Volumenverhältnis der Granula regulieren (Phasine, PhaP). Vorangegangene Arbeiten mit Ralstonia eutropha - dem Modellorganismus der PHB-Speicherung - zeigten, dass PHB-Granula in der frühen Phase ihrer Bildung nicht zufällig verteilt in der Zelle vorliegen, sondern gehäuft an den Zellpolen oder der inneren Seite der Cytoplasmamembran lokalisiert sind. Dies ließ eine spezifische Interaktion zwischen PHB-Granula-assoziierten Proteinen mit unbekannten Zielstrukturen in der Zellperipherie vermuten. Diese Annahme wurde durch die in der Literatur beschriebenen cytoskelettartigen Strukturen auf der Oberfläche nativer PHB-Granula unterstützt. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Proteine, welche spezifisch mit der PHB-Synthase oder anderen Oberflächenproteinen der PHB-Granula (z.B. Phasinen) interagieren, durch einen bakteriellen Two-Hybrid Assay identifiziert und anschließend auf ihre Beteiligung an der PHB-Granulabildung überprüft. Zur Identifizierung neuartiger Proteine des PHB-Granulumkomplexes wurden zudem weitere Methoden eingesetzt. PHB-Granula-assoziierte Proteine wurden ferner über eine Proteomanalyse isolierter PHB-Granula sowie eine Motivsuche nach Konsensussequenzen von Phasinen identifiziert. Im Zuge dieser Experimente konnten die vier bisher nicht beschriebene Proteine PhaP5 (H16_B1934), PhaP6 (H16_B1988), PhaP7 (H16_B2326) und PhaM (H16_A0141) identifiziert werden. Für diese Proteine konnte gezeigt werden, dass sie Phasin-ähnliche Eigenschaften aufweisen und mit den PHB-Granula assoziiert vorliegen. Insbesondere für PhaM und PhaP5 wurde nachgewiesen, dass diese Anzahl, Oberfläche/Volumen-Verhältnis und Lokalisierung der PHB-Granula regulieren können. PhaM war in der Lage mit dem Schlüsselenzym der PHB-Bildung der PHB-Synthase (PhaC1) zu wechselwirken. Weitere Protein-Protein-Interaktionen konnten zwischen PhaM und PhaP5 sowie zwischen PhaP5 und verschiedenen anderen Phasinen, dem Regulator der Phasin-Expression (PhaR) sowie der PHB-Depolymerase PhaZa1 nachgewiesen werden. Eine Überexpression von PhaM führte zu einer stark erhöhten Anzahl kleiner PHB-Granula, welche nahezu ausschließlich mit dem Nukleoid assoziiert waren. Bei Überexpression von PhaP5 waren die PHB-Granula hingegen überwiegend an den Zellpolen lokalisiert und ein Kontakt zum Nukleoid war nicht mehr nachweisbar. Zellen einer phaM-Deletionsmutante waren zudem in einer gleichmäßigen Aufteilung der Granula auf die Tochterzellen gestört und bildeten meist nur ein sehr großes PHB-Granulum. PhaM konnte aufgrund charakteristischer Alanine, Proline und Lysine (AAKP-Motive) im C-terminalen Bereich seiner Aminosäuresequenz den Histon H1-ähnlichen Proteinen zugeordnet werden. PhaM war in der Lage sowohl in vitro als auch in vivo unspezifisch an DNA (Nukleoid) zu binden. Aufgrund dieser Eigenschaften kann PhaM PHB-Granula physisch mit dem Nukleoid verknüpfen. Hierdurch wird gewährleistet, dass diese im Zuge der Chromosomensegregation und Zellteilung gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden. Anhand dieser neuen Erkenntnisse wurde ein Modell zur Verteilung der PHB-Granula während der Zellteilung entwickelt. In weiteren Experimenten wurde die Lokalisierung der PHB-Synthase untersucht und so neue Erkenntnisse zum Entstehungsort der PHB-Granula gewonnen. Dabei konnte gezeigt werden, dass PHB-Granula vermutlich nicht an der Zellmembran gebildet werden („Budding-Modell“). Die PHB-Synthase liegt hingegen ebenfalls über ihre Wechselwirkung mit PhaM an das Nukleoid gebunden vor. Das Nukleoid stellt damit den Bildungsort sowie Verankerungspunkt der PHB-Granula in der Zelle dar.

Poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) plays an important role as a storage compound for carbon and energy in many microorganisms. Intracellular PHB is deposited as waterinsoluble inclusion bodies (granules). Different proteins which are important for example for biosynthesis (PHB synthase, PhaC), intracellular mobilization (PHB depolymerase, PhaZ) or which control the size/volume-ratio (phasins, PhaP) are bound to PHB granules in vivo. Earlier work on Ralstonia eutropha - model organism for PHB metabolism - has shown a non random distribution of PHB granules in the cell, which are often located at the cell poles or near the cytoplasmic membrane during the early stages of formation. These results led to the assumption that localisation of PHB granules is controlled by interactions of PHB associated proteins with unknown proteins in the cell periphery. This assumption was supported by the recent identification of cytoskeleton-like structures on the surface of PHB granules. Therefore, a bacterial two-hybrid approach was applied to screen for proteins with the ability to interact with PHB synthase or other proteins (e.g. phasins) of the surface of PHB granules. Identified proteins were subsequently analysed for a possible role in PHB granule formation. Additional, PHB granule associated proteins were identified via proteome analysis of isolated PHB granules and by bioinformatical inspection of the R. eutropha genome for sequences with phasin motifs. This led to the identification of four yet undescribed proteins, namely PhaP5 (H16_B1934), PhaP6 (H16_B1988), PhaP7 (H16_B2326) und PhaM (H16_A0141), all of which showed phasin-like properties and were able to bind to the surface of PHB granules in vivo. Remarkably, PhaM and PhaP5 were able to control number, size and localization of PHB granules. PhaM strongly interacted with the key enzyme of PHB synthesis, the PHB synthase (PhaC1). Other interactions were found between PhaM and PhaP5 and between PhaP5 and several of the other phasins, with the regulator of phasin expression (PhaR) and with PHB depolymerase PhaZa1. Overexpression of PhaM resulted in formation of many small granules that were exclusively bound to the nucleoid region. In contrast, overexpression of PhaP5 resulted in localization of PHB granules near the cell poles and apparent detachment of PHB granules from the nucleoid. While the wildtype accumulated in average three to six medium-sized PHB granules, most cells of a constructed phaM deletion mutant formed only one big granule and distribution of granules to daughter cells was disordered. The C-terminal part of PhaM contained a high number of prolines, alanines and of residues with positive charge (lysines) that are reminiscent for histone-like proteins (AAKP motifs). PhaM was able to bind unspecifically to DNA in vitro and to the nucleoid in vivo. In conclusion, PhaM is able to link PHB granules physically with the bacterial nucleoid and to promote that PHB granules are equally separated during cell division and chromosome segregation. This finding was also confirmed for the wild-type. A new model of PHB granule formation and distribution during cell division was suggested. In order to identify the subcellular localisation of PHB granule formation the intracellular localisation of the PHB synthase was determined. Formation of PHB granules at the cytoplasmic membrane (budding model) could be disproved and evidence was obtained that the PHB synthase apparently is nucleoid bound via PhaM leading to a direct linkage of emerging PHB granules to the nucleoid.