Development, characterization, and application of a novel scale-down apparatus for the investigation of the scale-up dependent CO2/HCO3– stimulus in Corynebacterium glutamicum

Abstract

Industrial biotechnology is regarded as a key technology for the sustainable production of chemicals and biofuels from renewable raw materials. The economy-of-scale principle leads to a more frequent application of large scale, non-ideally mixed bioreactors of several hundred cubic meters. As a result, the cells are subjected to continuously changing micro-environments along their flow path, such as gradients of the CO2 partial pressure (pCO2), which results due to the tank hydrostatics in exceptional amounts of dissolved CO2/HCO3– towards the bottom of the reactor.

This thesis covered the first time investigation of “quasi-stationary” ’low’ (< 40 mbar) and ’high’ (> 300 mbar) pCO2 conditions on the growth kinetics and the transcriptional regulation in Corynebacterium glutamicum . Fermentations performed under ’high’ pCO2 levels resulted in initially enhanced biomass to substrate yields and similar total performance parameters as growth rate and substrate uptake, as well as enzyme activities of selected de-/carboxylating enzymes compared to the reference process. A global comparative transcriptional analysis revealed the importance of the global regulator DtxR (51 % of 117 differential genes) for growth in presence of ’high’ CO2/HCO3– levels, which was corroborated by the significantly reduced growth rate of a delta dtxR mutant. ’Low’ pCO2 led to a bi-level growth behavior with a growth rate reduction of 50 % in phase II. A complex regulatory mechanism in response to ’low’ CO2/HCO3– levels was deduced by combining the results of enzyme activity measurements (two-fold increase of glucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase activity), by-product formation (L-alanine and L-valine), and DNA microarray analyses (140 differential genes). It is therefore assumed that an amplified expression of thiamin pyrophosphate (TPP) biosynthesis genes occurs to enhance the activity of TPP-dependent reactions to finally increase the availability of CO2 in the cells.

The quantitative analysis of processes via carbon balancing is essential for advanced considerations such as flux analysis, especially under different CO2/HCO3– conditions. A novel balancing approach was established by using a total carbon analyzer that considers all carbon species in the liquid phase and in the biomass. Besides leading to completely matched balances of (96–100) %, it prevented false-negative underestimations and allowed the identification and assignment of balance gaps. In addition, it could be shown that considerable amounts of CO2/HCO3– dissolved in the culture medium, even under reference conditions, which in combination with inaccurate biomass carbon contents derived from the literature led to balance gaps of 24 % in the course of fermentations.

The quantitative understanding of large scale production environments is an important factor for the rational improvement of bioprocesses. Experimental approaches focus on the abstraction of real bioreactors using specially designed scale-down devices. For this purpose, a novel cascade bioreactor system was developed and established consisting of a 100 L main and two 1 L cascade reactors that can be operated and balanced independently.

The successful technical characterization and the verification by model and simulation approaches allowed the defined application of pCO2 gradients (delta pCO2 up to delta 260 mbar) and residence times in the bypass (cascade reactor 1 and 2) in dependence on the mixing and flow characteristics of large scale reactors up to 4 min. At the same time, it could be shown that process relevant secondary parameters such as the temperature and the pH can be kept constant in the course of cultivations. Fermentation experiments were performed using C. glutamicum wild-type and the L-lysine producer DM1933 by considering a mean residence time of 3.55 min and an incremental pCO2 gradient of (75–315) mbar. The phenomenological analysis demonstrated that pCO2 oscillation did not inhibit growth, substrate, and product kinetics compared to the reference process. Furthermore, comparative transcriptional analysis revealed a fast transcriptional response in reaction to the applied pCO2 gradient for the first time. The resulting system response correlated (linearly) in its entirety with the residence time of the cells and the intensity of the pCO2 stimulus. In this regard, 15 differential genes were identified after 1.74 min (delta 75 mbar), whereas 66 differential genes were observed after 3.55 min (delta 240 mbar).

Die industrielle Biotechnologie gilt als Schlüsseltechnolgie für die nachhaltige Produktion von Chemikalien und Treibstoffen aus nachwachsenden Rohstoffen. Daraus folgt unter Berücksichtigung von Degressionseffekten immer häuffiger die Verwendung großvolumiger, nicht ideal durchmischter Bioreaktoren mit mehreren hundert Kubikmetern. Somit erfahren die Zellen entlang ihres Strömungspfades kontinuierlich Änderungen in ihrer Mikroumgebung, z.B. CO2 Partialdruck (pCO2) Gradienten, was aufgrund der Hydrostatik gerade am Reaktorboden zu erheblichen Mengen an gelöst CO2/HCO3– führt.

In dieser Arbeit erfolgte unter “quasi-stationären” Bedingungen die erstmalige Untersuchung von sehr ’niedrigen’ (< 40 mbar) und ’hohen’ (> 300 mbar) pCO2 auf die Wachstumskinetik und die transkriptionielle Regulation in Corynebacterium glutamicum. Unter ’hohen’ pCO2 wurden neben einer initial erhöhten Biomasseausbeute ähnliche Leistungsparameter für Wachstumsrate und Substrataufnahme, sowie ausgewählte Aktivitäten de-/carboxylierender Enzyme im Vergleich zum Referenzprozess beobachtet. Eine vergleichende Transkriptomanalyse konnte die Bedeutung des globalen Regulators DtxR (51 % der 117 differenziellen Gene) für das Wachstum in Gegenwart ’hoher’ CO2/HCO3– Gehalte herausstellen, was durch signifikant langsameres Wachstum der Delta dtxRMutante untermauert wurde. ’Geringe’ pCO2 führten zu drei-phasigem Wachstum mit um 50 % reduzierter Wachstumsrate in Phase II. Ein komplexer Regulationsmechanismus in Reaktion auf ’geringe’ CO2/HCO3– Gehalte wurde durch die Kombination von Enzymaktivitätsmessungen (zweifache Erhöhung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase), Nebenproduktbildung (L-Alanin und L-Valin) und Transkriptomanalysen (140 differenzielle Gene) ermittelt. So liegt die Vermutung nahe, dass eine Verstärkung der Expression der Thiaminpyrophosphat (TPP)-Biosynthesegeneerfolgt, um die Aktivität TPP-abhängiger decarboxylierender Reaktionen zu steigern und so die CO2 Verfügbarkeit in der Zelle zu erhöhen.

Die quantitative Prozessauswertung via Kohlenstoffbilanzen ist für weiterführende Betrachtungen wie z.B. Stoffflussanalysen auch in Gegenwart veränderter CO2/HCO3– Gehalte essentiell. Unter Verwendung eines Kohlenstoffanalysators erfolgte die Etablierung eines Bilanzierungsansatzes, der die Gesamtkohlenstoffspezies sowohl in der Flüssigphase, als auch in der Biomasse berücksichtigt. Neben der vollständigen Bilanzierung zwischen (96–100) % konnten so falsch-negative Unterschätzungen vermieden und Bilanzierungslücken identifiziert und zugeordnet werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass sich bereits unter Referenzbedingungen erhebliche CO2/HCO3– Mengen im Medium lösen, was in Verbindung mit ungenauen Biomasse-Kohlenstoffgehalten aus der Literatur dazu führt, dass andernfalls Bilanzlücken von bis zu 24 % im Fermentationsverlauf auftreten.

Grundlage einer rational-getriebenen Verbesserung von Bioprozessen ist u.a. das quantitative Verständnis großvolumiger Produktionsumgebungen. Experimentelle Ansätze verfolgen die Abbildung realer Bioreaktoren in sogenannten „scale-down“ Reaktoranlagen. Hierfür erfolgte die Entwicklung und Etablierung eines neuartigen Kaskadenreaktors bestehend aus einem 100 L Haupt- und zwei 1 L Kaskadenreakoren, die jeweils individuell betrieben und bilanziert werden können. Die erfolgreiche verfahrenstechnische Charakterisierung und Verifizierung über Modell- und Simulationsansätze erlaubte die Abbildung definierter pCO2 Gradienten (Delta pCO2 bis zu 260 mbar) und Verweilzeiten im Bypass (Kaskadenreaktor 1 und 2) in Abhängigkeit der Misch- und Strömungszustände großskaliger Reaktoren von bis zu 4 min. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass prozessrelevante Sekundärparameter wie z.B. die Temperatur und der pH im Fermentationsverlauf konstant gehalten werden können. Unter Berücksichtigung einer mittleren Verweilzeit von 3.55 min, erfolgten Fermentationen mit dem C. glutamicum Wildtyp und dem L-Lysin Produzenten DM1933 unter Anwendung eines inkrementellen pCO2 Gradienten von (75–315) mbar. Die phänomenologische Untersuchung ergab, dass die pCO2 Oszillationen zu keinen signifikanten Inhibitionen von Wachtums-, Substrat,- und Produktkinetik im Vergleich zum Referenzprozess führten. Darüber hinaus veranschaulichten vergleichende Transkriptomanalysen für den Wildtyp-Prozess erstmalig eine schnelle transkriptionelle Antwort als Reaktion auf den applizierten pCO2 Gradienten. Die resultierende Systemantwort korrelierte (linear) in ihrer Gesamtheit sowohl mit der vorliegenden Verweilzeit der Zellen als auch mit der Intensität des pCO2 Stimulus. So wurden nach 1.74 min (Delta 75 mbar) 15 differenzielle Gene beobachtet, während nach 3.55 min (Delta 240 mbar) 66 differenzielle Gene identifiziert werden konnten.