Systematic analysis of the sequence-structure-function relationships of thiamine diphosphate-dependent enzymes

Abstract

Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes form a vast and diverse protein family, both in the sequence space and in their functional potential. Of particular interest are the enantioselective C-C bond forming and cleavage reactions catalyzed by those enzymes. In these reaction, different ThDP-dependent enzymes provide distinct enantio- and chemoselectivities with often narrow substrate and product ranges. This specificity, which is beneficial for the enantiopure synthesis of fine chemicals like 2-hydroxy ketones, limits the scope of accessible products. Investigations of crystal structures of different ThDP-dependent decarboxylases revealed steric properties in the active sites of those enzymes to control the enantio- and chemoselectivity (S-pocket and donor-acceptor concept). Subsequent application of those concepts by modulation of the steric properties of enzymes’ active sites enabled rational engineering of biocatalysts with desired, but often only moderate, non-physiological enantioselectivities. The major objective of this thesis was to systematically analyze the sequences and structures of this enzyme family and to elucidate the relationships between sequence, structure and function. Detailed understanding of those relationships is pivotal for rational engineering and therefore necessary for the design of biocatalysts with desired selectivities. As compared to the enormous size of this enzyme family only a small number of representatives were experimentally characterized. Even less ThDP-dependent enzymes were modified by mutations in order to analyze effects of distinct amino acid residues and still less were structurally determined. Since the systematic analysis of the sequence-structure-function relationships requires information on the structure and function of a major fraction of family members, methods were developed and applied to increase the amount of available structure and function information. By making use of homology modeling, putative atom coordinates for enzymes lacking experimentally determined structure information were predicted. In addition, by development of a new database system that combines sequence, structure and function information, the acquisition of accurate and comparable biochemical data unambiguously linked to the biocatalysts’ amino acid sequences was enabled. Comparability of biochemical data and deduction of functional roles of certain residues requires comparable biochemical data on the one hand and methods to compare residues from different enzymes on the other hand. Introduction of standard numbering schemes for ThDP-dependent enzymes facilitated fast and accurate comparison of structurally equivalent positions without the need for structure information. The findings derived from those analyses accelerated the engineering of enzymes with desired enantio- and chemoselectivities and inter alia enabled the enzymatic, direct asymmetric synthesis of (S)-benzoins with excellent ees.

Die Familie der Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängigen Enzyme ist gleichermaßen sequenziell als auch funktionell vielfältig. Besonderes Interesse wird dieser Familie aufgrund ihrer Fähigkeit zuteil, C-C Bindungs- und Spaltungsreaktionen zu katalysieren. Für einen Einsatz in der Biokatalyse und der Synthese von Feinchemikalien (wie beispielsweise alpha-Hydroxyketone) zeichnen sie sich zudem durch ihre definierten Substratspektren als auch ihre Enantioselektivität in zahlreichen Reaktionen aus. Allerdings schränken diese Spezifitäten das Spektrum an enzymatisch zugänglichen Produkten ein. Vergleichende Untersuchungen vorhandener Proteinstrukturen verschiedener ThDP-abhängiger Enzyme zeigten Unterschiede in der Form der Substrat-Bindetaschen der unterschiedlichen Vertreter. Die daraus abgeleiteten ’S-pocket’- und ’Donor/Akzeptor’-Konzepte führen diese sterischen Unterschiede und die resultierenden verschiedenen räumlichen Anordnungen der beiden Substrate in Ligationsreaktionen als die Ursache verschiedener Enantio- und Substratpräferenzen an. Auf dieser Grundlage konnten, durch Anpassung der Form der aktiven Taschen, Decarboxylasen mit geänderten Selektivitäten erzeugt werden. Oft allerdings einhergehend mit nur moderaten Stereoselektivitäten in der Katalyse nicht-natürlicher Reaktionen. Für den Erfolg von Rationalem Design von Biokatalysatoren mit gewünschten Eigenschaften sind detaillierte Kenntnisse über die Sequenz-Struktur-Funktions Zusammenhänge der jeweiligen Proteinfamilie von Bedeutung. Diese Doktorarbeit hatte die systematische Analyse dieser Zusammenhänge in ThDP-abhängigen Enzymen zum Ziel. Eine systematische Analyse von Sequenz-Struktur-Funktions Zusammenhängen erfordert implizit Sequenz-, Struktur- und Funktionsinformation für einen Großteil der zur Familie gehörenden Enzyme. In bisherigen Arbeiten wurden - relativ zu den enormen Ausmaßen dieser Proteinfamilie - nur wenige Vertreter experimentell charakterisiert. Für weiterführende Untersuchungen bezüglich des Einflusses bestimmter Aminosäure-Positionen auf die katalytische Aktivität oder Selektivität wurden nochmals nur wenige dieser Enzyme herangezogen. Eine experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur, welche für Rationales Design von Biokatalysatoren von besonderer Bedeutung ist, wurde nur für einen noch geringeren Bruchteil der ThDP-abhängigen Enzyme durchgeführt. Um dem bestehenden Mangel an Informationen über die Struktur und Funktion von Enzymen zu begegnen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteinstrukturen per Homologie-Modellierung vorhergesagt und Methoden zur Erfassung und Auswertung von Funktionsdaten entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen Datenbank-Systems zur Erfassung verlässlicher und vergleichbarer Daten über die Funktion und Sequenz von Enzymen, wurde die Basis für eine systematische Analyse der genannten Zusammenhänge geschaffen. Neben der Verfügbarkeit von Funktionsinformation, eindeutig mit der Sequenz des entsprechenden Enzyms verknüpft, erfordert die systematische Analyse möglicher funktioneller Bedeutungen einzelner Aminosäure-Positionen eine Methode zum Vergleich von Aminosäuren aus verschiedenen Enzymen. Eine solche Methode wurde mit dem hier präsentierten ’standard numbering scheme’ (Standard-Nummerierungs System) zur Verfügung gestellt. Die Anwendung dieser Methode erlaubt die schnelle und akkurate Identifikation strukturell äquivalenter Positionen in verschiedenen Enzymen ohne Abhängigkeit von Strukturinformation zu den jeweils analysierten Proteinen. Die aus diesen Analysen gezogenen Erkenntnisse wurden eingesetzt, um Biokatalysatoren mit gewünschten Enantio- und Chemoselektivitäten zu erzeugen und erstmals die enzymatische, direkte asymmetrische Synthese von (S)-Benzoinen zu ermöglichen.