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Autor(en): Merbitz, Andrea
Titel: Regulation der Hefezelle durch lichtvermittelte Kontrolle des mitotischen Zellzyklusprogramms
Sonstige Titel: Regulation of yeast cells by light-triggered control of the mitotic cell cycle program
Erscheinungsdatum: 2011
Dokumentart: Dissertation
URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:93-opus-67678
http://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/1356
http://dx.doi.org/10.18419/opus-1339
Zusammenfassung: Die mitotische Zellteilung ist die Basis der vegetativen Vermehrung von Zellen bzw. im Fall von Einzellern wie dem Pilz Saccharomyces cerevisiae ganzer Organismen. Die einfache Kultivierbarkeit im Labor macht S. cerevisiae zu einem idealen Forschungsobjekt. Dies gilt auch für das Studium der Mitose, da dieser Zellzyklusprozess ein hoch konservierter Vorgang ist und sich viele an der Hefe gewonnenen Erkenntnisse auf höhere Eukaryoten übertragen lassen. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Mitose ist essentiell für die Erforschung von Störungen des Zellzyklus, einschließlich solcher, die zu Krankheiten wie beispielsweise Krebs führen. Viele bereits gewonnene Erkenntnisse zur Zellteilung beruhen auf der Arbeit mit synchronen Zellkulturen, da diese im Gegensatz zu Mischpopulationen Einblicke in definierte Abschnitte des Zellzyklus ermöglichen. Im Laufe der vergangenen drei Jahrzehnte wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung synchron wachsender Populationen von S. cerevisiae entwickelt und standardisiert. Dazu gehören die Arbeit mit konditionellen Mutanten, metabolic shifts oder block-and-release-Verfahren (Walker, 1999). Ihnen allen gemein ist die Beschränkung auf nur einen einzigen synchronen Zellzyklusdurchlauf. Aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsraten von Mutter- und Tochterzellen wird schon im nachfolgenden Teilungszyklus eine Desynchronisierung beobachtet. Ein weiteres Problem ist, dass der zur Synchronisierung notwendige Zellzyklusarrest bei den etablierten Methoden nur durch umfangreiche Änderungen der Umgebungsbedingungen (z. B. die Änderung des Kultivierungsmediums, die Anwendung von Stressbedingungen wie erhöhter Temperatur) möglich ist. Entsprechend sind die Zellen im Verlauf der Synchronisation beträchtlichen Änderungen ihrer Physiologie ausgestzt. Für Studien über mehrere Zellzyklen hinweg ist die Entwicklung einer neuen Methode nötig, die eine wiederholte externe Steuerung der Zellproliferation mit möglichst minimal-invasiven Techniken ermöglicht. Die Vermeidung eines ständigen Wechsels des Nährstoffangebots oder der Inkubationstemperatur ist daher wünschenswert. Das lichtschaltbare Promotorsystem (Shimizu‑Sato et al., 2002) bietet hierfür eine gute Basis. Es ermöglicht die Expression eines unter der Kontrolle eines GAL1-Promotors stehenden Gens in Abhängigkeit von der Wellenlänge des Lichts, mit dem die Kultur bestrahlt wird. Als Zielgen, dessen Expression zur externen Ansteuerung der Mitose reguliert werden soll, wurde CDC20 gewählt. Cdc20 ist ein essentielles Protein und kontrolliert als Aktivator des APC (engl. anaphase promoting complex) die Trennung der Schwesterchromatiden in der Mitose und damit den Eintritt der Zellen in die Anaphase. Zur einfachen Handhabung und Vermehrung der Zellen sollte eine konditionelle cdc20-1-Mutante eingesetzt werden, die die Proliferation bei permissiven Bedingungen ohne die eventuelle Expression einer lichtgesteuerten CDC20-Kopie erlaubt. Ist die lichtabhängige Expression von 4mycCdc20 in diesem Stamm erfolgreich, so kann dies daran überprüft werden, dass sie den Phänotyp der konditionellen Mutante unter restriktiven Bedingungen komplementieren kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte eine temperatursensitive cdc20-1-Mutante mit der Fähigkeit zur zyklischen lichtabhängigen 4mycCdc20-Expression bei permissiver Temperatur hergestellt werden. Die Induktion der 4mycCdc20-Expression durch Licht einer Wellenlänge von 660 nm sowie deren Reprimierung durch eine Bestrahlung mit 750 nm ist in dieser Mutante bei permissiver Temperatur wiederholt möglich. Erwartungsgemäß geht dies nicht mit der Erzeugung einer synchron wachsenden Population einher, da unter diesen Bedingungen das Cdc20ts-Protein eine von der lichtabhängig exprimierten 4mycCdc20‑Kopie unabhängige Zellproliferation vermittelt. Für die Arbeit bei restriktiver Temperatur stellte sich dieser Stamm jedoch als ungeeignet heraus. Es konnte mit Hilfe von b-Galactosidase-Aktivitätstests gezeigt werden, dass die Ursache dafür der Verlust von ca. 80 % der Funktionalität des lichtregulierbaren Promotorsystems bei höherer Temperatur ist. Als Alternative wurde deshalb eine konditionelle methioninabhängige Stoffwechselmutante hergestellt. Diese ist bei 25 °C auch unter restriktiven Bedingungen zur lichtabhängigen 4mycCdc20-Expression fähig und in der Lage, das Wachstumsdefizit der Mutante zu komplementieren. Nähere Untersuchungen zur Verteilung der Kultur über die Zellzyklusphasen zeigen, dass sich zyklisch beleuchtete Kulturen hinsichtlich des DNA-Gehalts und der Expression des mitotischen Cyclins Clb2 signifikant von unbeleuchteten Kulturen unterscheiden. Somit wurden die Voraussetzungen für die Anwendung der lichtvermittelten Kontrolle des mitotischen Zellzyklusprogramms als neuer Technik zur Erzeugung synchroner Hefepopulationen erfolgreich geschaffen.
Mitotic cell division is a central step of vegetative cell proliferation and, in case of unicellular organisms as the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, reproduction of whole organisms. Handling and cultivating S. cerevisiae in laboratories is very easy. Moreover, S. cerevisiae is amenable to classical and molecular genetics. For these reasons budding yeast has become one of the main model organisms used for studies on mitosis as this process is highly conserved and lots of principles known from this fungal organism hold true for higher eukaryotes, too. Understanding the molecular basics of mitosis is essential for research on dysfunctions of proliferation, which is a major cause for several diseases as for example cancer. Today's knowledge about cell division has essentially requiered working with synchronous cell cultures. In contrast to mixed populations synchronized cells allow insights into selected phases of the cell cycle. During the past 30 years several methods which allow the generation of synchronously proliferating populations were developed and established. They include working with conditional mutants, metabolic shifts and block and release methods (Walker, 1999). All these methods have in common the limitation to only a single synchronous passage through the cell cycle. Due to differences in the rate of proliferation between yeast mother and daughter cells the population runs into dyssynchrony already during the next division cycle. An additional crucial problem of the established methods is the need for extensive alteration of the growth conditions (e.g. changing the medium or the temperature), inducing significant changes of cell physiology as well. To study yeast cell proliferation through multiple repeated cycles without changing the growth conditions it is necessary to design a new method that allows periodic external supervision of cell proliferation using a minimal invasive technique. The light-switchable promoter system (Shimizu‑Sato et al., 2002) appeared to be an excellent tool for the required system qualities. It enables the cells to express a gene under control of the GAL1-promoter in a light dependent manner. To trigger mitosis externally CDC20 was chosen as promising target gene. Cdc20 is an essential protein, which is acting as an activator of the anaphase promoting complex, licences cells to separate sister chromatids during mitosis. Thus, Cdc20 acts as an initiator of anaphase. A conditional temperature sensitive cdc20‑1‑mutant that allows proliferation independent from the optionally expression of light-triggered 4mycCdc20 was expected to provide easy handling of the strain. Assuming that it is possible to express 4mycCdc20 light dependent, the functionality of this system could be proved by checking whether the cells are able to complement the phenotype of the conditional mutant under restrictive conditions. During this work it was possible to construct a temperature sensitive cdc20-1 derived mutant strain, which was able to cyclically express 4mycCdc20 at permissive temperature (25 °C). As expected this didn't lead to synchronous yeast populations because the cells expressed functional Cdc20ts protein independent from light-triggered 4mycCdc20 under these permessive conditions. Unexpectedly, repeated induction of 4mycCdc20 expression through exposure to light of 660 nm wavelength and repression by light of 750 nm did not occure at restrictive temperature (37 °C). Thus, usage of this strain for repeated synchronization of a yeast population was impossible. Based on b‑galactosidase assays it could be shown that higher temperature leads to loss of about 80 % of the functionality of the light-switchable promoter system. To overcome this problem a conditional methionine dependent metabolic mutant was constructed. Light-triggered expression of 4mycCdc20 in this strain at 25 °C was successfull even under restrictive conditions. Moreover, the growth defect of the mutant was fully complemented. Regarding DNA content and the distribution of the mitotic cyclin Clb2 analysis of the cell cycle distribution of the culture uncovered a significant difference between populations that were cultivated enlightened and in the dark. With these results light could be successfully established as an inductor to control cell proliferation, which is the crucial step for permanent light-triggered synchronization of yeast populations.
Enthalten in den Sammlungen:03 Fakultät Chemie

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