Mikrobiologischer Abbau verzweigter kurzkettiger Aliphaten am Beispiel Methylpropen

Abstract

Die Stämme IBE100 und IBE200 wurden aus Belebtschlamm einer Kläranlage mit Methylpropen (MP) als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle isoliert. Mittels Vergleich der 16S rRNA sowie hsp65 Gensequenzabschnitte und Genom-basierter Taxonomie wurden die Stämme IBE100 und IBE200 den Spezies Mycolicibacterium gadium und Mycobacterium gordonae zugeordnet. Diese obligat aeroben Bakterien sind Oxidase- und Katalase-positiv, säurefest, nicht motil und bilden gelb-pigmentierte, kreisförmige, flache Kolonien aus. Aufgrund der wachsartigen Beschaffenheit der Zellen wurden Flüssigkulturen mit dem Detergenz Triton X-100 versetzt, um ein starkes Verklumpen zu vermeiden. Neben dem Isolationssubstrat Methylpropen (IBE100: µ = 0,018 h-1 und IBE200: µ = 0,025 h-1) unterscheiden sich die Stämme in der Nutzung der Substrate, die als alleinige Kohlenstoff- und Energiequellen verwendet werden können. Stamm IBE100 ist in der Lage, auf den vermuteten Metaboliten von MP, 1,2-Epoxy-2-methylpropan, 2-Methylpropan-1,2-diol, 2 Hydroxyisobuttersäure, 3-Hydroxybuttersäure sowie Glucose, Fructose und Vollmedien (LB, NB, TB) zu wachsen, Stamm IBE200 hingegen nicht. Strukturanaloga von MP und seinen Metaboliten (verzweigte kurzkettige Alkene, Epoxide, vicinale Diole), zyklische aliphatische Verbindungen und Aromaten induzierten bei beiden Stämmen kein Wachstum. Die cometabolische subterminale Oxidation von n-Butan durch dieselbe Monooxygenase, die MP oxidiert, wurde ebenso nachgewiesen wie ihre Induzierbarkeit durch MP und die Indigobildung aus Indol. Eine am Abbauweg von MP beteiligte Alkohol-Dehydrogenase, welche die Oxidation von 2 Methylpropan-1,2-diol katalysiert, ist nicht homolog zu beschriebenen Enzymen gleicher Funktion, die in Abbauwegen von tert-Butanol und 2-Methylpropan-1,2-diol vorkommen. Es konnte gezeigt werden, dass die Dehydrogenase im Zellextrakt NADP gegenüber NAD bevorzugt. Aus der Sequenzierung des Gesamtgenoms, einer differenziellen Expressionsanalyse und einem Peptidmassen Fingerprint wurde ein Abbauweg für Methylpropen abgeleitet. Die identifizierten Schlüsselgene codieren für eine lösliche 4-Komponenten-di-Eisen-Monooxygenase mit Epoxidase-Aktivität, eine Epoxid-Hydrolase und eine 2 Hydroxyisobutyryl-CoA-Mutase. Die Tertiärstrukturen dieser Enzyme wurden modelliert. In beiden Stämmen sind die beteiligten Gene in Clustern von 61,0 bzw. 58,5 kbp in einer erstaunlich hoch konservierten Operonstruktur angeordnet. Diese Cluster enthalten auch die Gene, die für Teile des aeroben Synthesewegs von Adenosylcobalamin codieren, einem Vitamin, das für die von der Mutase katalysierte Kohlenstoffumlagerungsreaktion erforderlich ist. Eine Konvergenz mit dem tert-Butanol-Abbauweg wurde ersichtlich, jedoch konnte der Alkohol selbst aufgrund des Fehlens der erforderlichen spezifischen Oxygenase nicht als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Dies ist der erste Nachweis eines Abbauweges für MP auf genetischer Ebene (Helbich et al. 2023), der bisher rein auf Transformationsanalysen mit vermuteten Metaboliten beruht, die aus MTBE-Abbauexperimenten postuliert wurden. Die für die Epoxidierung von MP verantwortliche Monooxygenase wurde als Mitglied der Gruppe 2 der löslichen Monooxygenasen des Aromaten-/Alken-/Isopren-Typs identifiziert, die aus einer Oxygenase-α-Untereinheit IbeA, einer γ-Untereinheit IbeB, einem Ferredoxin vom Rieske-Typ IbeC, einem Kopplungsprotein IbeD, einer β-Untereinheit IbeE und einer flavinhaltigen NAD(P)H-Reduktase IbeF besteht. Die Tertiärstruktur der α-Untereinheit IbeA wurde modelliert und mit ihrer nächsten Verwandten, der Isopren-Monooxygenase aus Rhodococcus sp. AD45, verglichen. Die Geometrien des vorhergesagten aktiven Zentrums und der Substrattunnel lassen auf eine gewisse sterische Einschränkung bei der Substratverwertung schließen. Die Monooxygenase wurde in dem n-Alkan abbauenden Mycobacterium fluoranthenivorans BUT6 mit pST-K, einem E. coli-Mycobacterium-Shuttle- und Expressionsvektor, heterolog exprimiert. Für die Ausbildung einer katalytischen Aktivität war eine Inkubationstemperatur von ~20 °C erforderlich. Die Monooxygenase war trotz der gescheiterten Expression der Reduktase-Komponente IsoF aktiv. Die Umwandlung von MP in 1,2-Epoxy-2-methylpropan in ruhenden Zellen wurde kolorimetrisch mit dem NBP-Assay nachgewiesen (KM = 271 mM, vmax = 46 mM ⋅ h-1).