Untersuchungen zur Expression, Funktion und Regulation der ABC-Transporter P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 beim Menschen

Abstract

Das Ausmaß der Wirkung eines Arzneimittels hängt von seiner Konzentration am Wirkort ab. Zu niedrige Konzentrationen des Wirkstoffes haben keinen erwünschten therapeutischen Effekt beim Patienten. Im Gegensatz dazu bewirken zu hohe Arzneimittelkonzentrationen häufig toxische Nebenwirkungen. Arzneimitteltransporterproteine sind neben Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen für die Pharmakakonzentration am Wirkort verantwortlich. Das Verständnis der Ursachen interindividueller Unterschiede in der Expression solcher Transporterproteine kann somit dazu beitragen, interindividuelle Unterschiede in der Arzneimittelwirkung zu verstehen. In dieser Arbeit wurden zwei ATP-binding cassette Transporterproteine, P-Glykoprotein und Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Polymorphismus in Exon 26 des humanen MDR1-Gens (C3435T) mit einer reduzierten P-Glykoproteinexpression und -funktion assoziiert ist. Träger dieses Polymorphismus (3435 TT) zeigten eine niedrigere P-Glykoproteinexpression in Leukozyten als Probanden mit dem CC-Genotyp. Zur Ermittlung der P-Glykoproteinfunktion wurde der Efflux des P-Glykoproteinsubstrates Rhodamin123 aus Leukozyten mit der höchsten P-Glykoproteinexpression (CD56+ NK-Zellen) gemessen. Die P-Glykoproteinfunktion in CD56+ NK-Zellen von Individuen mit dem Genotyp 3435 TT in Exon 26 des MDR1-Gens war signifikant niedriger als bei Individuen mit dem CC-Genotyp. Die Abhängigkeit der P-Glykoproteinexpression vom MDR1-Genotyp wurde auch in Plazenta- und Kolongewebe untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die P-Glykoproteinexpression in humanem Plazentagewebe durch den Polymorphismus C3435T in ähnlicher Weise wie in den CD56+ NK-Zellen beeinflusst wurde. In Fällen, in denen Mutter und Kind den gleichen Genotyp hatten, führte die Mutation in Exon 26 des MDR1-Gens (3435 TT) zu einer 40 %igen Reduktion der P-Glykoproteinexpression in Plazentagewebe. Diese Befunde bedeuten, dass Arzneimittel, welche P-Glykoproteinsubstrate sind (z. B. HIV-Proteaseinhibitoren), niedrigere Konzentrationen in den Leukozyten von Individuen mit dem Genotyp 3435 CC erreichen und somit möglicherweise eine geringere Wirksamkeit haben (z. B. bei HIV). Eine genetisch-bedingte, niedrigere P-Glykoproteinexpression in der Plazenta dürfte die Anreicherung von Xenobiotika im Feten verstärken und könnte somit ein erhöhtes Teratogenitätsrisiko darstellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation von Multidrug Resistance Protein 3 untersucht. Eine Analyse von 62 humanen Lebern zeigte eine erhebliche Variabilität der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression. Der Protonenpumpenhemmer Omeprazol wurde als Faktor identifiziert, der zu einer signifikanten Erhöhung der Multidrug Resistance Proteins 3 Expression im Lebergewebe von Patienten führt. Durch in vitro Experimente konnte die Induktion des Multidrug Resistance Proteins 3 durch Omeprazol bestätigt werden. Weitere Experimente zeigten, dass der Aryl Hydrokarbon Rezeptor am Mechanismus der Induktion von Multidrug Resistance Protein 3 durch Omeprazol beteiligt ist. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass Gallensäuren die Expression von Multidrug Resistance Protein 3 in CaCo-2 Zellen induzieren. Da die Expression von ABC-Transporterproteinen häufig in Tumorgewebe induziert ist und somit zur Multidrug Resistance bei der Chemotherapie beiträgt, wurde die MRP3-Expression in Kolon-Tumorgewebe untersucht. Es konnte jedoch bei diesem Tumor eine niedrigere MRP3-Expression im Vergleich zu gesundem Kolongewebe nachgewiesen werden. Mit dieser Arbeit wurden Faktoren identifiziert, die zu einer variablen Transporterprotein-expression beitragen. Das bessere Verstehen dieser Einflussfaktoren könnte somit einen Beitrag zu einer individualisierten, sichereren Arzneimitteltherapie leisten.

Drug disposition is an important factor influencing success of drug treatment. The intensity and duration of drug action and possible toxic side effects depend on the drug concentration at the site of action. If the same dose of a drug is administered to patients, substantial interindividual differences in drug concentrations have been observed. Whereas the role of drug metabolism has been characterised, it was only recently appreciated that some proteins can transport drugs in and out of the cell. As these transporter proteins are expressed in intestine, liver and kidney, they will affect the absorption and elimination of drugs. Moreover, the transfer of drugs from blood into brain or lymphocytes is controlled by these transporters. Since there is substantial variability in the expression, even at identical plasma concentrations, drug efficacy can differ, as cellular drug concentration at the site of action is different. Knowledge about mechanisms for interindividual variability in expression and function of such active transport systems contributes to improved efficacy and safety of drug therapy. This thesis reports analysis of expression, function and regulation of the two active transport systems for drugs, P-glycoprotein and multidrug resistance protein 3 (MRP3). It has been shown, that a polymorphism in exon 26 (C3435T) and exon 21 (G2677T) of the human MDR1 gene is associated with reduced P-glycoprotein expression and function. Carriers of the polymorphism 3435TT or 2677TT showed reduced leukocyte MDR1 mRNA expression compared with wild-type individuals. Moreover, P-glycoprotein function measured by rhodamine efflux from CD56+ NK-cells was significantly lower in individuals carrying the polymorphism 3435TT or 2677TT. It has also been examined whether P-glycoprotein expression in human placenta and colon is also influenced by the MDR1 genotype. This thesis reports that P-glycoprotein expression is influenced by the MDR1 genotype in human placenta similarly as it is in CD56+ NK-cells. P-glycoprotein levels were lower, when both mother and child were homozygous for the mutant allele (3435 TT) compared to homozygotes for the wild-type allele. Moreover, placentas from mothers carrying both polymorphisms (3435T and 2677T; TT/TT) showed also a significantly lower P-glycoprotein expression compared to placentas of wild-type individuals. Finally, MDR1 mRNA in colon tissues of patients with different MDR1-genotypes was analysed by TaqMan RT-PCR and Western blotting. Individuals with the 3435 CC genotype showed a trend for higher MDR1 mRNA levels compared to individuals with the 3435 TT genotype. Taken together, polymorphisms C3435T and G2677T of the MDR1 gene are associated with lower P-glycoprotein expression and could therefore be important factors for variable drug concentrations during e. g. HIV-therapy and fetal exposure to xenobiotics. In the second part of this thesis, expression and regulation of multidrug resistance protein 3 (MRP3) was analysed. The link between transporter function and drug disposition and effects is not characterized for MRP3 so far. Using in vitro studies in combination with clinical samples, induction of this ABC transporter involved in homeostasis of endogenous compounds as well as in drug disposition was found. Omeprazole has been identified as a factor being responsible for this variability in MRP3 expression in human liver and HepG2 cells. Livers of patients treated with omeprazole showed 4.8-fold higher MRP3 protein expression compared with the remainder of the population. Accordingly, MRP3 mRNA and protein were induced 2.4- and 1.8-fold, respectively, in HepG2 cells treated with omeprazole. Moreover, evidence is provided for the putative mechanism of MRP3 induction by the Ah receptor pathway. In vitro incubation experiments of CaCo-2 cells with bile acids also showed an induction of MRP3 expression by litocholic acid and chenodeoxycholic acid. Finally, MRP3 mRNA in non-tumours-colon tissues and colon tumour tissues of 9 patients was analysed by TaqMan RT-PCR. MRP3 mRNA levels were significantly lower in colon tumour tissues compared with non-tumours colon tissues, whereas MRP3 protein expression was not different in these tissues. Taken together, the findings of this work improved the understanding on expression, function and regulation of two active drug transport systems and might therefore contribute to a safer drug therapy.