Metabolic engineering of the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum to produce industrially interesting plant carotenoids at high level and low cost

Abstract

The purple non-sulphur photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum has been genetically engineered to express carotenoids, including plant-derived ones, at high level. Initially, a lycopene-producing R. rubrum strain, SLYC18, was constructed by chromosomal replacement of the late genes of the carotenoid biosynthesis, crtCD, with a kanamycin cassette. SLYC18 showed a longer lag phase than the wild-type, followed by normal growth under both photoheterotrophic and chemoheterotrophic conditions. Absorption spectroscopy and mass spectrometry of extracted carotenoids showed that SLYC18 produced lycopene almost exclusively at high levels (2 mg lycopene/g dry weight cells) under semi-aerobic, dark conditions in a high cell density medium. Using biochemical and spectroscopic analysis showed that lycopene was bound exclusively to the light-harvesting (LH) 1 complexes and reaction centers. SLYC18 exhibited also wild-type levels of LH1 complexes and intracytoplasmic membrane (ICM). In a similar strategy, the crtCD region was replaced with an Arabidopsis thaliana lycopene β-cyclase (crtL) gene flanked by a kanamycin resistance gene, to yield the β-carotene producing strain SWGK46. SWGK46 showed a higher sensitivity to oxidative stress compared to SLYC18, but still could achieve high growth rates in the exponential growth phase and yield wild-type cell densities in the stationary phase when grown both photo- and chemoheterotrophically, respectively. SWGK46 produced β-carotene at a high level of 4.4 mg/g dry weight cells in a high cell density medium. SWGK46 expressed LH1 complexes with a unique Qy near-infrared absorption maximum at 877 nm, corresponding neither to that of LH1 complexes with bound (882 nm) or no carotenoid (874 nm), respectively, indicating that β-carotene is assembled into the LH1 complexes which exist in an altered conformation. In contrast to all other carotenoid-containing strains of R. rubrum observed so far, the β-carotene content of the ICM exceeded that of the bound LH1 complex, indicating that β-carotene has also been released into the ICM phase, implying that CrtL is able to activate the endogenous carotenoid biosynthesis enzymes. Continuous growth passages of SWGK46 yield three secondary mutant phenotypes. Under dark, oxidative chemoheterotrophic conditions a brown secondary mutant (designated SWGK46B) was obtained, which exhibited strongly depressed levels of carotenoid and ICM, and a new absorption maximum at 420 nm, due to an early precursor (a protoporphyrin IX derivative) of bacteriochlorophyll biosynthesis. This phenotype is characteristic of the response of R. rubrum to extreme oxidative stress. Under photoheterotrophic conditions, two green secondary mutants (SWGK46GR and SWGK46GIRR, respectively) were observed. SWGK46GR exhibited strong carotenoid down-regulation when grown photoheterotrophically, but β-carotene production was resumed when the cultures were transferred to chemoheterotrophic conditions. The SWGK46GIRR strain showed the same phenotype under light conditions but did not resume carotenoid production when grown chemoheterotrophically in the dark. The induction of the green secondary mutants was shown to be blue light-dependent. These phenotypes have never been observed in any other R. rubrum strain so far, and probably arise from a protein-protein interaction between CrtL and the R. rubrum carotenoid biosynthesis enzymes. DNA sequence analysis indicated that the green phenotypes are due to mutation of the early genes of carotenoid biosynthesis, crtIB. Bioinformatics analysis of the A. thaliana flavoprotein CrtL indicated domains with possible sequence and structural homologies to known blue light sensors, in particular to plant flavoprotein cryptochromes, as well as to the cyanobacterial 3'-hydroxyechinenone-containing orange carotenoid protein. Possibly, the response of the lycopene β-cyclase to blue-green light may play a role in the putative interaction with the CrtIB, and thereby stimulate the production of secondary mutations.

Das photosynthetische Nicht-Schwefel Bakterium Rhodospirillum rubrum wurde mit Hilfe molekularbiologischer Methoden für die Überexpression verschiedener, auch pflanzlicher, Carotinoide optimiert. Zunächst wurden die Gene crtCD, die für die späten Carotinoid-Biosynthese-Enzyme kodieren, im Chromosom mit einer Kanymycin-Resistenzkassette ersetzt, und so der Lycopin produzierende R. rubrum Stamm SLYC18 erzeugt. SLYC18 zeigte eine längere Lag Phase als der Wildtyp, wuchs aber normal unter sowohl photoheterotrophen als auch chemoheterotrophen Wachstumsbedingungen. Mittels Absorptionsspektroskopie und Massenspektrometrie extrahierter Carotinoide wurde gezeigt, dass SLYC18 unter semi-aeroben Wachstumsbedingungen in einem Hochzelldichte Medium im Dunkeln fast ausschließlich Lycopin in großen Mengen (2 mg Lycopin / g Trockengewicht Zellen) produzierte. Biochemische und spektroskopische Analysen zeigten, dass Lycopin ausschließlich an die Lichtsammelkomplexe 1 (LH1) und Reaktionszentren gebunden war. Von SLYC18 wurden Wildtyp Mengen an LH1 Komplexen und intracytoplasmatischen Membranen (ICM) erreicht. Mittels einer ähnlichen Strategie wurde die chromosomale crtCD Region durch ein Arabidopsis thaliana Lycopin β-Zyklase Gen (crtL) zusammen mit einem flankierenden Kanamycin Resistenzgen ersetzt und so der β-Carotin produzierende Stamm SWGK46 erzeugt. SWGK46 zeigte im Vergleich zu SLYC18 eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress, konnte aber dennoch sowohl bei photo- als auch chemoheterotropher Inkubation große Wachstumsraten in der exponentiellen Wachstumsphase und Wildtyp Zelldichten in der stationären Phase erreichen. SWGK46 exprimierte LH1 Komplexe mit einem besonderen Qy Nah-Infrarot Absorptionsmaximum bei 877 nm, das weder zu dem von carotinoidhaltigen LH1 Komplexen (882 nm) noch carotinoidlosen Komplexen (874 nm) passte, was darauf hindeutete, dass β-Carotin in LH1 Komplexe eingebaut war, die in einer veränderten Konformation vorlagen. Im Gegensatz zu allen bislang beobachteten R. rubrum Stämmen, war der β-Carotin Gehalt der ICM höher als der durch Carotinoid Bindung am LH1 Komplex erreichbare Gehalt, was darauf hinwies, dass β-Carotin auch in die ICM Phase freigesetzt wurde, woraus geschlussfolgert werden konnte, dass CrtL die endogenen Carotinoid-Biosynthese-Enzyme aktivieren kann. Nach mehrfachen Überimpfungspassagen von SWGK46 traten drei Sekundärmutanten mit verschiedenen Phänotypen auf. Unter oxidativen chemoheterothrophen Wachstumsbedingungen im Dunkeln wurde eine braune Sekundärmutante (SWGK46B) erhalten, die extrem erniedrigte Carotinoid und ICM Level zeigte und deren Absorptionsspektrum ein neues Maximum bei 420 nm aufwies, das von einer frühen Bakteriochlorophyll Vorstufe (ein Protoporphyrin IX Derivat) herrührte. Dieser Phänotyp ist charakteristisch für die Antwort von R. rubrum auf extremen oxidativen Stress. Unter photoheterotrophen Wachstumsbedingungen traten zwei grüne Sekundärmutanten (SWGK46GR und SWGK46GIRR) auf. Bei SWGK46GR wurde die Carotinoidproduktion während photoheterotropher Inkubation stark herunterreguliert, doch nach Transfer zu chemoheterotrophen Bedingungen setzte die β-Carotin Produktion wieder ein. SWGK46GIRR zeigte im Licht denselben Phänotyp, konnte jedoch im Dunkeln bei chemoheterotrophem Wachstum die Carotinoidproduktion nicht wieder aufnehmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion der grünen Sekundärmutanten Blaulicht-abhängig war. Diese Phänotypen sind bislang in keinem anderen R. rubrum Stamm beobachtet worden und treten eventuell aufgrund einer Protein-Protein Wechselwirkung zwischen CrtL und den R. rubrum Carotinoid-Biosynthese-Enzymen auf. Mittels DNA Sequenzanalyse konnte geschlossen werden, dass die grünen Phänotypen durch Mutationen der frühen Gene der Carotinoid-Biosynthese, crtIB, verursacht sind. Bioinformatische Analyse des A. thaliana Flavoproteins CrtL zeigte Domänen mit möglichen Sequenz- und Struktur-Homologien zu bekannten Blaulicht Sensoren insbesondere den pflanzlichen Flavoprotein Cryptochromen, sowie dem cyanobakteriellen 3-Hydroxyechinenon-enthaltenden Orange Carotenoid Protein. Die Antwort der Lycopin β-Zyklase auf blau-grünes Licht könnte eine Rolle bei der möglichen Interaktion mit CrtIB spielen und somit die Bildung von Sekundärmutationen stimulieren.