Browsing by Author "Braun, Bernhard Sebastian"

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Die Ubiquitin-Proteasom vermittelte Regulation gluconeogenetischer Enzyme in Hefe: die Funktion der RING Untereinheiten der Gid-Ubiquitin Ligase
(2012) Braun, Bernhard Sebastian; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)
In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass neun sogenannte GID (glucose induced degradation deficient) Gene für den reibungslosen Ablauf der Katabolit-induzierten proteasomalen Degradation von Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) essentiell sind. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sieben der Gid-Proteine (Gid1, Gid2, Gid4, Gid5, Gid7, Gid8 und Gid9) in einem Proteinkomplex vorliegen (Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). Gid3/Ubc8 ist in diesem Prozess das Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2) (Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). Gid6 ist identisch mit Ubp14, einem deubiquitinierenden Enzym (Pickart, 1997). Gid4 dient als "molekularer Schalter" des Abbauprozesses von FBPase, da es in weniger als fünf Minuten nach Glucosegabe zu gluconeogenetisch gewachsenen Zellen exprimiert wird und die Ubiquitinierungsreaktion von FBPase einleitet (Santt et al., 2008). Mittels bioinformatischer Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass Gid2/Rmd5 und Gid9/Fyv10 Domänen mit einer hohen Ähnlichkeit zu bekannten RING-Finger-Proteinen besitzen. Durch die Mutation hochkonservierter Aminosäuren in diesen Proteinbereichen konnte der FBPase-Abbau nach Glucosegabe zu gluconeogenetisch gewachsen Zellen beinahe vollständig unterbunden werden. Gid2 ist in der Lage, Proteine in vivo und in vitro zu polyubiquitinieren. Gid2 ist damit maßgeblich für die E3 Ubiquitin-Ligaseaktivität des Gid-Komplexes verantwortlich. In Gid9 führt die Mutation der degenerierten RING-Domäne in vivo zu einem vollständigen Ausbleiben der Ubiquitinierungsreaktion von FBPase, Phosphoenolpyruvatkarboxykinase (PEPCK) und cytoplasmatischer Malatdehydrogenase (c-MDH) und verhindert so deren weiteren proteasomalen Abbau. Gid2 und Gid9 interagieren miteinander und bilden ein für RING-Finger-Proteine typisches Heterodimer aus. Diese Interaktion wird durch die Mutation/Deletion der konservierten LisH-/CTLH-Proteindomänen nur unwesentlich beeinflusst. Das Gid2/Gid9 Heterodimer bindet unabhängig von weiteren Gid-Untereinheiten an Gid1, das "Gerüst"-Protein des Gid-Komplexes. Mittels Gelfiltrationschromatographie war es möglich, die Größe des Gid-Komplexes erstmals genauer zu bestimmen. Der Gid-Komplex fraktioniert zwischen dem Fettsäuresynthasekomplex und dem Aminopeptidasekomplex 1 bei etwa 1000 kDa. Eine Interaktion zu seinen Substratproteinen konnte auf diese Weise nicht nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von TOR1 in Saccharomyces cerevisiae zum Absterben der Zellen bei Wachstum auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen führt. Tor1 ist eine essentielle Komponente des TOR-Signalnetzwerkes, durch das zahlreiche Zellfunktionen wie Wachstum und Metabolismus gesteuert werden.