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Open Access
Accessing nature's terpenome by squalene-hopene cyclase mediated asymmetric cationic cyclization cascades
(2022) Schneider, Andreas; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Die Arbeit befasst sich mit der Erschließung der Squalen-Hopen Zyklase als Biokatalysator für die organische Chemie. Dadurch werden Synthesewege zu hochkomplexen Terpenen stark vereinfacht.
Open Access
Alternative active site confinement by enforcing substrate pre-organization in cyclases
(2023) Schell, Kristina; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Confinement of an enzyme’s active site is critical to the efficiency of chemical reactions and has been recognized as an important tool for catalysis. Confined active sites facilitate the pre-organization of substrates and intermediates to control the reaction course, protect against premature quenching and provide unique products. The catalytic center activates the substrate, and its activity can be enhanced by residues surrounding the substrate in the active site, changing the local catalyst geometry, and maintaining a constrained structural and/or electronic configuration of the catalytic center. These properties are characteristic of confinement, resulting in the generation of proximity between the substrate and the catalytic center, as well as complementary binding of the substrate into the active site. Effectively, this accelerates the reaction, controls the progress of the reaction, and positions the substrate in a productive conformation. The reaction course is selectively controlled by the stabilization of intermediates and by the interaction of electron-rich residues with electron-poor molecules and vice versa. Despite these benefits, a strongly confined active site is inherently limited to compounds that resemble the native substrate, with only small deviations tolerated. This restricts the applications for new reactivities and prevents broad substrate scopes. In this work, analysis of the enzyme structure in combination with iterative saturation mutagenesis were employed for the development of biocatalysts with alternative confinement and productive substrate pre-organization. To unlock the potential of confined Brønsted acid catalysts this approach was applied on terpene synthases. These enzymes form several carbocations as transition states and intermediates, which can be selectively converted by confinement of the active site. Exploiting the potential of terpene synthases to convert modified terpene scaffolds could provide interesting building blocks with branched isoprene/terpene motifs. In addition, the control of the reaction progression to specific products rather than a mixture of products could be targeted by stabilizing carbocation intermediates or transition states. The present work demonstrates a structure-guided strategy to create an alternative confinement in the squalene hopene cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC). This strategy aims to create proximity between substrate and catalytic center and complementarity between substrate and active site to obtain productive pre organization of the substrate. This may allow the conversion of geranylacetone (GA), farnesol and farnesylacetone analogs as substrates with modified isoprene patterns. Among different rational and semi-rational approaches only variant G600M (VD1), in which the substrate tunnel was modified, yielded starting activity. Structural analysis of VD1 led to the identification of a bottleneck in the tunnel. This resulted presumably in steric interactions and proximity by decreasing average distances between the double bond of the substrate’s terminal isoprene unit and the catalytic center. Furthermore, a lower fluctuation of these distances around this mean value was observed in VD1 compared to the wild type (WT). These observations support the hypothesis of improved substrate pre-organization and confirm the creation of proximity between the substrate and the catalytic center. The development of a screening method and optimization of reaction conditions facilitated iterative saturation mutagenesis to investigate the evolvability and the potential of the approach. The positions for saturation mutagenesis targeted the shape complementarity of the active site to the GA analog dihydropseudoirone, and the finally developed variant (VD5) showed an 1174-fold increase of the total turnover number and 111-fold increase in catalytic efficiency compared to the WT. Creation of alternative active site confinement demonstrates evolvability and great potential to overcome limitations in the engineering of biocatalysts and allowed the generation of novel building blocks in preparative mg scale. Limitations in the generation of alternative confinement were approached by using lycopene cyclases. These catalysts convert linear lycopene to carotenes under physiological conditions and were mainly studied for the conversion of pseudoionones in this work. The latter substrate could not be converted by AacSHC through generation of alternative confinement. Three different lycopene cyclases were tested, of which CanLCY B showed immediate activity in converting pseudoionone to a monocyclic product. AthLCY-B and AthLCY-E initially showed no conversion of selected terpenes. After optimizing the reaction conditions, a multiple sequence alignment (MSA) was performed to identify non-conserved positions around the catalytic acid of LCY-B. It was hypothesized that these amino acids influence the confinement and the pre-organization of the substrate. Saturation mutagenesis at the identified positions improved β-Ionone formation by 4-fold and conversion by 5% with variant V335L compared to the WT. The applicability of this MSA-based alternative confinement strategy for engineering of further lycopene cyclases was demonstrated by using saturation mutagenesis of the respective residues in AthLCY-E. Under optimized conditions α-Ionone product formation increased 4.5-fold with the best performing variant AthLCY-E S359F compared to WT AthLCY-E. Application of lycopene cyclases to complement activities with challenging steric interactions demonstrated the successful expansion of the diversity for protonation reactions by biocatalysts and the successful application of an MSA-based approach to generate alternative confinement. To further investigate the generation of alternative confinement and expand the toolbox of Brønsted acid catalysis, the acid isomerization of monoterpenes catalyzed by squalene hopene cyclases (SHCs) was investigated. To access selective product formation with monoterpenes a strategy based on cation stabilization was applied to overcome the challenging pre-organization of the cyclic C10 compounds. The focus was on aromatic residues with high electron density and residues surrounding the carbocation to direct the reaction course toward a single monoterpene product. In an initial screening, four monoterpenes were converted by AacSHC, resulting in complex product mixtures. Of these, one monocyclic and one bicyclic substrate were selected for further engineering. The goal here was to increase the formation of terpinen-4-ol, a hydrated monoterpene. In addition, limonene that was not converted by AacSHC was tested. Optimization of reaction conditions and semi-rational engineering to stabilize the carbocation intermediate produced improved variants in terms of selectivity and terpinen-4-ol formation. Saturation mutagenesis of hydrophobic amino acids that interact with the docked substrate and surrounding residues resulted in variants VT3 and VS2, which had the best selectivity and the highest measured terpinene 4-ol formation, respectively. VT3 converted monocyclic terpinolene with a selectivity of 64% and with a 3.4-fold increase in total turnover number (TTN) compared to the WT. The highest terpinene-4-ol formation of 219 µM and a 2-fold increase in TTN compared to the WT was measured with the bicyclic compound sabinene. Features, such as bulkier residues at position 600, found in VT3 and VS2 are likely responsible for generation of alternative confinement by the positioning of aromatic residues, which stabilize cationic intermediates along the reaction trajectory towards terpinene-4-ol formation. Creating alternative confinement shows great potential for overcoming limitations in biocatalyst engineering. Interesting building blocks were generated and new reactivities with improved selectivity in protonation reactions have been discovered. Moreover, this strategy could be used for predicting potential hot spots in enzyme engineering campaigns and data-driven predictions of enzyme functions to decipher the catalytic potential of enzyme scaffolds.
Open Access
Asparaginsäure-vermittelte enzymatische Reaktionen
(2016) Kühnel, Lisa C.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Promiskuität zweier Enzyme aus unterschiedlichen Proteinklassen, die allerdings auf eine gemeinsame, in der Biochemie sehr häufige Reaktion, die Säure-(Base)-Reaktion, zurückgreifen. Beide Enzyme verwenden die Asparaginsäure als katalytisch aktive Aminosäure, wobei Haloalkan Dehalogenasen aus der alpha/beta-Hydrolase-Familie, die deprotonierte Form der Asparaginsäure als nukleophiles Aspartat verwenden, wohingegen die Squalen-Hopen-Zyklasen die protonierte Asparaginsäure als Brønsted-Säure nutzen. Das Substratspektrum der Dehalogenase LinB aus Sphingobium japonicum, das sonst nur halogenierte Alkane umfasst, sollte um alternative Substrate erweitert werden. Es konnte erfolgreich demonstriert werden, dass LinB eine eindeutige Hydrolyseaktivität gegenüber organischen Thiocyanaten und Isothiocyanaten aufweist, was auf erstmals beschriebene promiskuitive Eigenschaften der LinB schließen lässt. Es konnte gezeigt werden, dass Substrate von unterschiedlicher Größe toleriert werden, um dabei Alkohole und Amine zu generieren. Mittels rationalem Design konnten Varianten erzeugt werden, die eine deutliche Verbesserung gegenüber der Bildung von Benzylamin demonstrierten. Zur Untersuchung der Art der Promiskuität, wurden sogenannte knockout-Mutanten der katalytischen Triade der LinB erstellt und für Studien bezüglich des Katalysemechanismus herangezogen. In der Tat konnte über die einfache Substratpromiskuität hinaus, katalytische Promiskuität der LinB in Bezug auf die organischen Isothiocyanate gezeigt werden. Anhand der Squalen-Hopen-Zyklase aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurden Untersuchungen bezüglich intermolekular katalysierter Reaktionen vorgenommen. Diese Fähigkeit der Etherbildung ist zwar bei der nativen AacSHC anhand des Substrates Farnesol bekannt, allerdings nur in geringem Umfang. So konnte mittels Varianten aus einer fokussierten Mutantenbibliothek eine 10-fache Steigerung der Produktbildung erzielt werden. Ferner konnten unter Verwendung nicht-natürlicher Substrate und unterschiedlicher Nukleophile neue, nicht-literaturbekannte intermolekular gebildete Produkte dargestellt werden. Durch die Wahl des Nukleophils und dessen Konzentration gelang es, Produktverhältnisse eindeutig zu Gunsten der intermolekular gebildeten Produkte zu verschieben.
Open Access
Biocatalytic allylic oxidation with bacterial P450 monooxygenases
(2023) Bogazkaya, Anna Maria; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Diese Forschungsarbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und Charakterisierung geeigneter Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) in Streptoyceten. Durch eine Dünnschichtchromatographie (DC)-Methode wurden zwei vielversprechende Streptomyces-Stämme identifiziert. Aus diesen Stämmen wurden die Enzyme CYP105A1, CYP105B1, CYP105D5 und CYP170A1 kloniert und in E. coli zur weiteren Untersuchung exprimiert. Da die natürlichen Redoxpartner dieser CYPs unbekannt sind, wurde ein heterologes Redoxsystem aus Pseudomonas putida verwendet. Diese Arbeit liefert wichtige Einblicke für die industrielle Anwendung dieser Enzyme in der biokatalytischen Oxidation. Interessanterweise zeigten die Studienergebnisse, dass drei der ausgewählten CYPs (CYP105B1, CYP105D5 und CYP170A1) zyklische Modell Substrate wie α- oder β-Ionon auf eine regioselektive Weise zu Allylalkoholen hydroxylierten. Diese Reaktion erzeugt spezifisch Allylalkohole, was eine hohe Regioselektivität zeigt - das heißt, die Enzyme zielten gezielt auf bestimmte Teile der Moleküle ab, um sie zu oxidieren. Andererseits führte die Oxidation von azyklischen Substraten mit diesen Enzymen zu einer Mischung von regioisomeren Epoxiden. Dies zeigt eine Vielseitigkeit der Enzyme, aber auch eine Variation in der Produktverteilung, abhängig von der Struktur des Ausgangssubstrats. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, das Verständnis für die Funktionsweise und die potenzielle Anwendung von CYPs in der Synthese von spezifischen und wertvollen Produkten zu erweitern. Sie unterstreichen das Potenzial von CYPs als leistungsstarke Werkzeuge in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie, wo selektive und effiziente Oxidationsmethoden dringend benötigt werden. Zur Vereinfachung der Anwendung dieser Ganzzellkatalysatoren in industriellen Prozessen wurde ein innovativer Ansatz zur Immobilisierung dieser Zellen in einer Latex SF091-Schicht erarbeitet, dank der Zusammenarbeit mit Prof. Michael Flickinger von der NC State University, USA. Nach erfolgreicher Immobilisierung der Zellen zeigten die Reaktionen eine bemerkenswerte Produktselektivität: Bei der Oxidation von Nerol mit CYP154E1 wurden 97% 8-Hydroxynerol und nur 3% 2,3Epoxynerol erzeugt.
Open Access
Biokatalyse chemisch betrachtet : Fallstudien aus der technischen- und aus der Labor-Synthese
(2015) Löw, Sebastian A.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Die Biochemie ist ein vergleichsweise junger Zweig der Chemie, obwohl sie schon seit Jahrtausenden vom Menschen im täglichen Gebrauch eingesetzt wird. Möchte man die Werkzeuge der Biochemie auf aktuelle chemische Fragestellungen anwenden wird die Dominanz der biologischen Sichtweise auf diesem Gebiet deutlich. In dieser Arbeit wurden biochemische Projekte mit Verbesserungspotential durch organisch chemische Herangehensweise optimiert. Werden bei einer Synthese die sekundären Parameter, z.B. die Nachhaltigkeit oder Reaktionssicherheit, auf Kosten der primären Parameter wie Ausbeute oder Reaktionsdauer verbessert oder leidet die generelle Effektivität einer Reaktion, besteht Handlungsbedarf. Da die biochemische Rifamycin S-Synthese durch die Verwendung eines aufwendigen Oxidationsmittels, der Meerrettichperoxidase, zwar nachhaltig aber nicht mehr effizient von statten ging, wurden Alternativen dazu aufgezeigt und optimiert. Die vorgestellte Oxidation von Rifamycin B zu Rifamycin O und dessen direkte Hydrolyse büßte nichts an Effektivität gegenüber dem bestehenden Prozesses ein und gewann dennoch ein hohes Maß an Nachhaltigkeit dazu. In einem weiteren Projekt wurde die biochemische Reduktion aktivierter C=C-Doppelbindungen vom organisch-chemischen Standpunkt aus betrachtet. Für diese Reaktion, basierend auf der Reduktion des Enzym-Flavins durch NADH-Cofaktoren, wurden NADH analoge Cofaktoren synthetisiert. Die von Hammett beschriebenen Substituenten-Effekte konnten hierbei für das elektrochemische Potential der synthetischen Cofaktoren gezeigt werden. Darüber hinaus konnte ein Cofaktor entwickelt werden mit dem die enzymatische Reduktion zehn Mal schneller als mit dem natürlichen Cofaktor möglich war. Eine weitere Anwendung fand diese Sichtweise bei der Betrachtung enzymatisch katalysierter Carbenreaktionen. Für die NH-Insertion konnte das Substratspektrum deutlich erweitert, sowie gänzlich neue Stoffklassen zur Reaktion gebracht werden. Dabei wurde ein Set neuer E.coli-eigener Proteine, die zur Katalyse von Carbenreaktionen geeignet sind, entdeckt. Die wohl bedeutendste Entdeckung dieser Arbeit ist die Protein-unterstütze Carbonyl-Olefinierung mit Carbenen. Die Durchführbarkeit dieser Reaktion mit E.coli Proteinen könnte die Grundlage zu einer biologischen und nachhaltigen Anwendung der Wittig-artigen Carbonyl Olefinierung sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine chemisch inspirierte Biologie ebenso interessant ist wie der umgekehrte häufiger angewandte Fall. Für das Feld der synthetischen Biologie ist dies ein wichtiger Fingerzeig für zukünftigeOptimierungsansätze.
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Biosynthese von Carotinoiden mittels rekombinanten Mikroorganismen
(2010) Beuttler, Holger; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Diese Arbeit entstand aus einem gemeinsamen Projekt des Instituts für technische Biochemie (ITB) und des Instituts für Industrielle Genetik (IIG) an der Universität Stuttgart. Während das Institut für Industrielle Genetik für die molekularbiologischen Arbeiten zuständig war, oblagen dem Institut für Technische Biochemie, die Kultivierung und die Analytik. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Synthese von Carotinoiden in rekombinanten Pseudomonas putida KT2440 mit Zeaxanthin als Modellprodukt untersucht werden. Insbesondere sollten limitierende Schritte bei der Biosynthese identifiziert werden. Die Synthese der Carotinoide erfolgt dabei aus der zugefütterten Kohlenstoffquelle, meist Glucose. Aus dieser werden in mehreren Schritten die Vorstufen des Isoprens, das Isopentenylpyrophosphat (IPP) und das Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) gebildet. Aus den beiden Vorstufen wird im bakteriellen Isoprenkatabolismus nun über die Zwischenstufen Geranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat, Geranylgeranylpyrophosphat gebildet. Die zur Synthese der Carotinoide nötigen Enzyme werden durch Expression von einem Plasmid gebildet. Die Gene stammten aus dem natürlichen Carotinoidproduzenten Pantoea ananatis. Mit Hilfe dieser Enzyme wird dann das Tetraterpen Phytoen und aus diesem, nach einer mehrstufigen Einführung von Unsättigungen, das erste farbige Tetraterpen, das acylclische Lycopin gebildet. In weiteren Modifikationen können die Enden zum ß-Carotin zyklisiert und die Ringe schließlich zum Zeaxanthin hydroxyliert werden. Zur Hydroxylierung des ß-Carotins wurden die Cytochrom-P450-Monooxygenase CYP175A1 aus Thermus thermophilus und die beiden ß-Carotinhydroxylasen aus Pantoea ananatis (CrtZ) und Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev) verglichen. CrtZBrev und CYP175A1 zeigten deutlich niedrigere Ausbeuten als CrtZ. Zur Analyse der gebildeten Produkte wurde eine Methode der HPLC etabliert und so angepasst, dass eine gute Trennung der Substanzen möglich war. Ferner wurde zur schnellen Untersuchung einer großen Zahl von Proben eine Methode der Dünnschichtchromatographie neu entwickelt. Als bei guter Ausbeute am einfachsten durchführbar erwies sich die Extraktion der Carotinoide mit Aceton. Es wurden Wiederfindungsraten > 97 % erhalten. Mehrere am IIG mit Hilfe der Transposonmutagenese erhaltene Mutanten zeigten eine höhere Transformationseffizienz als dem Wildtyp. Auch die produzierte Zeaxanthinmenge war größer. Die Mutante D7L3 (1,51 mg Zeaxanthin pro Gramm Biotrockenmasse) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Beim Vergleich der beiden Vollmedien LB- und TB-Medium sowie dem Mineralmedium MEK zeigte sich, dass in TB-Medium mit Glycerin als zusätzlicher Kohlenstoffquelle mit 7,0 mg/g die mit Abstand höchste Zeaxanthinmenge hergestellt werden konnte. In LB-Medium lag die Ausbeute bei 1,3 mg/g und in MEK-Medium mit Glucose bei 2,5 mg/g. Die volumetrische Ausbeute war ebenfalls in TB-Medium mit 51,3 mg/l am höchsten. Bei LB- und MEK-Medium lag sie mit 2,2 mg/l beziehungsweise 1,7 mg/l deutlich niedriger. Während der Produktion stieg die Zeaxanthinmenge kontinuierlich an. Es wurden weiterhin ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin in sehr geringen Mengen gefunden. Es konnten 0,1 mg/g ß-Carotin beziehungsweise 0,6 mg/g ß-Cryptoxanthin in TB-Medium gemessen werden. In LB- und MEK-Medium waren die Mengen noch niedriger. Andere Carotinoidvorstufen konnten nicht nachgewiesen werden. Aus den erhaltenen Daten kann abgeleitet werden, dass die Hydroxylierung den Engpass bei der Zeaxanthinsynthese darstellt, da hier die Zwischenstufen gefunden werden konnten, während die anderen Reaktionen ohne Akkumulierung von Zwischenstufen abliefen. Es konnte durch CD-Spektroskopie und chirale Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, dass es sich bei dem in P. putida gebildeten Zeaxanthin um das (3R,3’R)-Isomer handelt. Das Expressionssystem wurde auch in E. coli verwendet. Die Ausbeute im besten Fall war hier aber deutlich niedriger und lag bei 2,4 mg/g. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute in P. putida D7L3 wurden verschiedene Additive zum Medium geprüft. Am vielversprechendsten erwies sich Lecithin. Ein Zusatz von 10 % Lecithin vermochte innerhalb von 24 Stunden die Zeaxanthinmenge um das 10,4fache auf 216 mg/g zu steigern. Die Hochskalierung vom Schüttelkolben in den 5 l-Fermenter war erfolgreich, die Ausbeute blieb jedoch hinter der im Schüttelkolben deutlich zurück. Außerdem wurde die Bildung von Alginat beobachtet. Dies führte dazu, dass die Kultivierung nach spätestens zwei Tagen abgebrochen werden musste. In TB-Medium wurden Zeaxanthinausbeuten von 20 mg/l, in Mineralmedium wurde eine Ausbeute von 1,2 mg/l erreicht. Wurden Teilernten durchgeführt, bei welchem die Hälfte des Mediums einmal täglich gegen frisches Medium getauscht wurde, konnte die Ausbeute auf 5,1 mg/l gesteigert und die Kultivierung über drei Tage geführt werden. Bei Teilernten war das Produkt auch mit Lycopin verunreinigt.
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Biosynthese von N-Heterocyclen mittels Putrescinoxidase und Iminreduktase
(2018) Weinmann, Leonie; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer neuen Enzymkaskade zur Synthese von N-Heterocyclen. Vor allem chirale N-Heterocyclen bilden wichtige Vorstufen für die Synthese von Pharmazeutika oder Agrochemikalien und sind daher von besonderem industriellem Interesse. Über 90% der potenziellen pharmazeutischen Wirkstoffe beinhalten Stickstoff und viele davon in Form von substituierten Piperidinderivaten, weswegen stetig nach neuen Synthesewegen gesucht wird. Für die Entwicklung einer neuen alternativen Enzymkaskade wurden die Putrescinoxidase von Rhodococcus erythropolis (PuO-Re) und die (R)-selektive Iminreduktase von Streptosporangium roseum (IRED-Sr) oder die (S)-selektive Iminreduktase von Paenibacillus elgii (IRED-Pe) gewählt um chirale N-Heterocyclen ausgehend von Diaminderivaten, die z.B. über die Decarboxylierung von Aminosäuren zugänglich sind, herzustellen. In dieser Kaskade oxidiert die PuO-Re eine Aminogruppe der Diamine, wodurch ein Aminoketon entsteht. Dieses Aminoketon cyclisiert spontan unter Bildung einer Schiff-Base, dieses Imin kann dann von der Iminreduktase mit dem Kofaktor NADPH zum gesättigten N-Heterocyclus reduziert werden. Da die Aktivität der PuO-Re für längerkettige oder verzweigte Diamine im Vergleich zum natürlichen Substrat 1,4-Diaminobutan drastisch abnimmt, wurde ein semi-rationales Design durchgeführt um die Aktivität gegenüber Diaminopentanderivaten zu steigern und das Substratspektrum zu erweitern. Dabei konnten zwei Varianten identifiziert werden, die eine gesteigerte Umsatzzahl für ebendiese Substrate aufweisen. Um eine weitere Steigerung der Aktivität zu erreichen wurde ein rationales Design für die aktive Tasche angewendet, dabei konnte eine Variante erstellt werden, die aliphatische Monoamine als Substrat akzeptiert und weitere zwei Varianten mit gesteigerter Aktivität gegenüber 1,5-Diaminohexan. Mit der Variante, die aliphatische Monoamine als Substrate akzeptiert, konnte gezeigt werden, dass die PuO-Re bei verzweigten Aminen, die weniger gehinderte Aminogruppe oxidiert. Alle positiven PuO-Re Varianten wurden erfolgreich mit den beiden IREDs kombiniert und die beste Umsetzung eines substituierten Diamins resultierte in vitro in 90% Produktbildung. Erstaunlicherweise konnte bei der Umsetzung von 1,5-Diaminohexan zu 2-Methylpiperidin in der Kaskade ein Switch im Enantiomerenüberschuss, zwischen den PuO-Re Varianten aus dem semi-rationalen Design und dem rationalen Design der aktiven Tasche, beobachtet werden. Somit konnte in der aktiven Tasche die Position 206 identifiziert werden, die verantwortlich ist für die Unterscheidung der Enantiomere von 1,5-Diaminohexan. Des Weiteren wurde die Kaskade mit einer der PuO-Re Variante in Kombination mit der IRED-Sr in ein in vivo System übertragen. Dabei konnte durch Variation des E. coli Stammes und durch Reaktionsoptimierung die Produktbildung von 3-Methylpiperidine aus 1,5-Diamino-2-methylpentan von 10% auf 83% gesteigert werden. Eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen in Kooperation mit Sanofi führte zu einer Umsetzung von fast 30 mM 1,5-Diamino-2-methylpentan zu 3-Methylpiperidin in einem 20 L Reaktor.
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Biotechnologische Herstellung von Octan- und 8-Hydroxyoctansäure mit Escherichia coli
(2016) Kirtz, Marko; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
In den letzten 20 Jahren rückt die Entwicklung biotechnologischer Prozesse zur Produktion von Diesel- und Benzinersatzstoffen immer mehr in den Fokus von Forschung und öffentlichem Interesse. Durch die Verknappung der Erdölressourcen[1], die negativen Auswirkungen der extensiven Nutzung dieser Ressourcen auf die Umwelt und nicht zuletzt das stetig wachsende Umweltbewusstsein der Bevölkerung in Industrieländern, wurden Prozesse gefordert, die auf regenerierbaren Ressourcen basieren, somit den permanent in Richtung Atmosphäre gerichteten CO2-Fluss eingrenzen und zudem die Kostenexplosion für Kraftstoffe eindämmen. Jedoch ist nicht nur der weltweite Transportsektor von Erdöl und seinen weiterverarbeiteten Produkten abhängig, auch die produzierende chemische Industrie bezieht einen Großteil ihrer Grundstoffe aus dem „schwarzen Gold“[2,3,4,5]. Hier gilt es, effektive alternative Prozesse zu entwickeln, die zum Großziel einer „grünen Chemie“ beitragen und von der Abhängigkeit von Erdöl losgelöst sind. Diese Arbeit hatte das Ziel durch die Realisierung eines mikrobiellen Produktionsprozesses von mittelkettigen Fett- und ω-Hydroxyfettsäuren einen Beitrag zum Ziel der sog. „grünen Chemie“ zu leisten. Die wirtschaftliche und damit einhergehend umweltschutztechnische Relevanz von Fettsäuren und ihren terminal hydroxylierten Derivaten spiegelt sich in der großen Vielfalt an Produkten, deren Grundbausteine sie bilden, wider. Zum Einsatz kam hier das Bakterium Escherichia coli, für welches bereits in vergangenen Studien Strategien entwickelt worden waren, um beispielsweise (Hemi-)Cellulosen für den Aufbau von eigener Biomasse verwerten zu können[6]. Daher ist es für einen Ansatz, der auf regenerierbaren Ressourcen beruhen soll, bestens geeignet. Um mit diesem Bakterium in einem Produktionsprozess Fettsäuren zu generieren, musste seine native Fettsäurebiosynthese zu einer Überproduktion der gewünschten Fettsäure angeregt werden. Dazu wurde die pflanzliche Thioesterase FatB2 aus Cuphea hookeriana[7] in einer β-oxidationsdefizienten Zelle überexprimiert, um sowohl die Fettsäuresynthese zu deregulieren als auch gleichzeitig die Länge des Produktes zu bestimmen. Nach einer N-terminalen Fusion des Enzyms mit dem Thioredoxin-1-Anhang trxA und einigen Optimierungen des Produktionsprozesses, konnten mit diesem System in 24 h etwa 330 mg/L der für die Zellen toxischen Fettsäure Octansäure in einem Bioreaktor-fed batch-Verfahren hergestellt werden. Um aus dieser Fettsäure ihr ω-hydroxyliertes Derivat zu formen, wurde in den Produktionsstamm zusätzlich ein Monooxygenase-Fusionsprotein eingebracht, das bereits aus früheren Arbeiten des ITBs hervorging[8,9]. Das Fusionsprotein von CYP153A aus Marinobacter aquaeolei mit der Reduktasedomäne CPR von CYP102A1 aus Bacillus megaterium ist in der Lage sich selbst mit Reduktionsäquivalenten zu versorgen ohne dabei auf die Hilfe einer zusätzlichen Reduktase angewiesen zu sein. Die in dieser Arbeit verwendete Mutante G307A ist zudem gegenüber Octansäure um das 20-fache aktiver als es die Wildtypform ist[9]. Diese Enzymmutante wurde in vier unterschiedlichen Ansätzen mit dem octansäureproduzierenden Bakterienstamm kombiniert. So konnte letztlich in einem Einzellsystem mit paralleler Expression der Thioesterase sowie der Monooxygenase in 20 h ein 8-Hydroxyoctansäure-Titer von etwa 230 µM erreicht werden, was umgerechnet 40 mg/L entspricht. Nachdem der erfolgreiche konzeptionelle Beweis für dieses Produktionssystem erbracht war, sollte ein ungerichtetes Mutageneseverfahren angewendet werden, um die Möglichkeit das Endprodukt nach Wunsch in seiner Länge variieren zu können, zu erhalten. Das Verfahren sollte gentechnisch veränderte Thioesterase-Varianten generieren, die verglichen zum eingesetzten Wildtypenzym eine erhöhte Aktivität gegen kürzere oder längere Fettsäuren als Octansäure aufwiesen. Für ein hierzu benötigtes high throughput screening-Verfahren sollten im Rahmen dieser Arbeit die Grundlagen erarbeitet werden. Getestet wurden dabei verschiedene Methoden des screenings sowohl auf Agarplatten und in Flüssigmedium, so beispielsweise die extrazelluläre Präsentation des Enzyms auf Hefezelloberflächen[10], als auch die Möglichkeit eines screenings mittels aufgereinigtem Enzym.
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Challenges in biocatalysis - case studies on protein expression, engineering and application
(2013) Kazenwadel, Christian; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Biotechnology is emerging as a key technology in the 21st century. In the past years, scientific and technological advances have established the field of biocatalysis as a competitive alternative to traditional metallo- and organocatalysis in chemical synthesis. Yet many, often basic challenges remain in the key steps of biocatalytic processes, which include the biocatalyst production, characterization, engineering, and application as well as down-stream processing. In the scope of this thesis, three case studies were performed to illustrate solutions for selected, critical challenges in these key steps. The first case study featured dirigent proteins, which are involved in the stereoselective control of the first step of lignan biosynthesis, the phenoxyl radical coupling of coniferyl alcohol radicals to yield optically pure (+)- or (-)-pinoresinol. Up to now, extraction of dirigent proteins from plant material or expression in plant and insect cell culture systems resulted in low yields. The metylotrophic yeast Pichia pastoris was evaluated as a possible host for recombinant protein expression. A reliable high yield fed-batch fermentation process with Pichia pastoris resulting in 47 mg mL-1 of the dirigent protein AtDIR6 representing a more than 250-fold increase compared to other sources was established. Biochemical characterization of AtDIR6 produced with Pichia pastoris showed an overall agreement in protein structure, N-glycosylation sites, and dirigent activity compared to AtDIR6 produced by plant cell cultures of Solanum peruvianum, validating Pichia pastoris as a suitable expression system for dirigent proteins. Enzymatic deglycosylation of the protein induced conformational changes leading to the loss of function and subsequent protein aggregation. This demonstrated that the glycan structures of AtDIR6 are essential for structure, solubility, and function of the protein. The second case study focused on a ribokinase from Saccharomyces cerevisiae, which was engineered for an altered substrate spectrum by rational protein design. The enzyme was produced in high yields in a heterologous expression system using Escherichia coli as host and biochemically characterized for the first time. Optimum reaction conditions were investigated regarding the dependency on mono-, di-, and pentavalent ions and the pH. Conditions featuring 100 mM potassium phosphate at pH 6.0 with 2.5 mM magnesium chloride were found to offer the highest catalytic activity. Based on a family alignment and rational design using a homology model of the protein, a small focused library of the ribokinase featuring 72 variants was established. The library was evaluated for alterations in the substrate spectrum with a focus on D-xylose, which is an epimer to the natural substrate D-ribose. More radical alterations such as triple and quadruple mutations abolished catalytic activity towards D-ribose and D-xylose almost completely. Several variants were identified broadening the substrate spectrum to other tetroses, pentoses, and hexoses, albeit with low catalytic efficiency. A single variant exhibited about twice the activity of the wild-type enzyme towards D-xylose (0.77 s-1 versus 0.38 s-1), which can serve as a basis for further studies. In this regard, an attempt to solve a crystal structure for more information about D-xylose binding in the active site was started. While several well diffracting crystals were obtained, molecular replacement did not lead to a solution of the structure so far. The third case study featured a cutinase from the ascomycete Humicola insolens, which was applied as a novel biocatalyst for the synthesis of functionalized acrylic esters by transesterification. The transesterification of methyl acrylate with 6-mercapto-1-hexanol at a high molar ratio in a solvent free system was studied. The enzyme was employed in immobilized form on a microporous, polystyrenic resin to facilitate the usability and stability in a non-aqueous environment and allow simple recovery of the biocatalyst. Besides two minor by-products, 6-mercapothexyl acrylate ester was identified as the main product with the thiol as the functional end group. By optimization of the reaction conditions and critical water content, the transesterification yielded 95.4 ± 0.3% of 6-mercaptohexyl acrylate ester after 6 h at 40°C in the presence of 0.025% (w/w) water without formation of by-products in a solvent free system. When applying methyl methacrylate as an acyl acceptor, transesterification with 6-mercapto-1-hexanol was significantly lower (43.6 ± 0.1%).
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Characterization and application of novel imine reductases
(2016) Scheller, Philipp; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Chiral amines are an ubiquitously distributed class of bioactive compounds, what turns them into preferred scaffolds for pharmaceuticals. The high chemical and enantiomerical purities required for such an application are ideally suited for biocatalysis as enzymatic methods routinely display high specificities. The established methods for chiral amine synthesis with lipases, ω-transaminases and amine oxidases, however have considerable limitations regarding their access to pharmaceutically relevant chiral secondary and tertiary amines. Recently the new enzyme class of imine reductases (IREDs) was described, offering an attractive extension to the currently used techniques as the preparation of imines by chemical methods in organic solvents is a well established and widely applicable method. As the number of IREDs known initially was limited to only three enzymes, this project started with a database search for the discovery of novel enzymes. For the first time it was shown that the IRED family is much larger than assumed and over 350 novel, putative IREDs were identified. A sequence analysis of the database members revealed (R)- type and (S)- type superfamilies and led after an update to the identification of IRED specific sequence motifs. These criteria allowed to define this new enzyme family on a sequence level and discriminate them from the closest related homologues. Based on the biochemical information about the three published IREDs and a conservation analysis of the database members, three new enzymes from Streptosporangium roseum DSM43021, Streptomyces turgidiscabies and Paenibacillus elgii were selected for characterization. The enzymes were shown to encode for functional IREDs with much higher activity than the previously known IREDs. By site directed mutagenesis the mechanism of the IREDs was probed and the importance of a conserved Tyr for catalysis of an (S)- type IRED shown, while the crucial role of the proposed Asp residue for catalysis in the (R)- type IREDs was questioned. The characterization of the new IREDs revealed their pH optima and confirmed the suspected dimerization. The thermostability of the IREDs was investigated and the selected (S)- type IRED identified as the most stable enzyme known to date. Further the activity in the presence of water miscible organic solvents was tested and high tolerance versus MeOH found. In biotransformations all IREDs showed high activity and a broad panel of cyclic imines was fully converted to piperidines and tetrahydroisoquinolines with enantioselectivities up to 99% ee. With purified IREDs kinetic constants for these substrates were recorded and their substrate preference investigated. This indicated a preference of the (S)- type IRED for more bulky substrates, compared to the (R)- type IREDs. After optimization of the reaction conditions, with purified IREDs also high activities and chemo- as well as enantioselectivities for very labile exocyclic imines were detected. The possibility to effectively reduce already low levels of such imines led to the application of one (R)- type IRED for the generation of novel C-N bonds by reductive aminations. The established methodology revealed the crucial influence, conditions that favor imine formation (high molar excess of the amine nucleophile and high pH) display on the conversion rates. Under optimized conditions, different carbonyls could efficiently be transformed with a variety of amines in the aqueous buffer system with moderate to good conversions into primary and secondary (chiral) amines with very high selectivities (ee up to 98%). Finally, an application of IREDs in cascade reactions to produce saturated N-heterocyclic compounds was envisioned. A microbial putrescine oxidase (PuO) was chosen to selectively oxidize polyamines to aminoaldehydes, thereby triggering their spontaneous cyclization to an imine. To target a broad range of heterocycles, PuO was characterized with a range of unnatural polyamines. The results indicated a narrow substrate scope and low activity for these compounds. To enhance the activity for such substrates directed evolution of PuO with epPCR was performed and led to the identification of a Glu residue, representing a hotspot for mutagenesis. This residue aligns to one of the multiple channels that lead into the deeply buried active site of PuO and it is located in the second shell around the active site. By site-saturation mutagenesis further mutants in the active site and this channel were generated and many mutants with smaller amino acids demonstrated the influence of this hotspot position to increase the activity of the enzyme. The best mutant exhibited considerably increased activities (up to 25-fold) for unnatural polyamines and also for natural polyamines the substrate spectrum was strongly shifted from putrescine towards longer polyamines like spermidine which is now transformed with a 10-fold increased catalytic efficiency (kcat/KM). The combination of both enzymes in purified form as well as in whole cells enabled the production of heterocyclic amines relying on the consecutive transformation of the substrate by both enzymes. While with the whole cell system only low amounts of the N-heterocyclic compounds were produced, the utilization of purified enzymes led in case of all three IREDs to high conversions of different polyamines into pyrrolines and piperidines.
Open Access
Characterization of the substrate specificity of squalene-hopene cyclases (SHCs)
(2013) Seitz, Miriam; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Cyclic terpenoids form a large group of natural products with various biological functions. About 60,000 different cyclic terpenoids have been identified by now, containing scaffolds of ten to more than 30 carbon atoms. Among this huge amount of different cyclic compounds, there are many well-known flavors and fragrances, such as menthol or limonene, compounds which are widely used for pharmaceutical purposes like the antitumor compound Taxol and the anti-malaria agent artemisinin, or common membrane constituents and hormones such as the sterols. All of these natural products are derived from cyclization reactions of few linear precursor molecules catalyzed by terpenoid cyclases. The main focus of the present work rests on one very interesting family of the terpenoid cyclases, the squalene-hopene cyclases (SHCs). Among the over 300 annotated SHCs, most extensive studies had been carried out characterizing the SHC from the thermophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC), solving the crystal structure and the complex cyclization mechanism of the C30 precursor squalene into the pentacyclic products hopene and hopanol. This reaction constitutes one of the most complex reaction mechanisms found in nature, including the stereospecific formation of nine stereocenters and 13 covalent bonds.13 Besides AacSHC, several SHCs were partially characterized in previous works. Our interest was triggered by the ethanol and sugar tolerant strain Zymomonas mobilis which is known as one of the most potent hopanoid producers. Zymomonas mobilis contains two genes encoding for SHCs: ZmoSHC1 and the formerly partially characterized ZmoSHC2. It could be shown that the SHCs are also capable of cyclizing other linear terpenoids. For example, it was found that truncated squalene analogs were accepted as substrates by AacSHC and also the alcohol homofarnesol could be converted into the corresponding cyclic ether ambroxan.16–19 These results indicate that SHCs represent a promising family for catalysis of very different and complex cyclization reactions. Thus, we decided to investigate the SHCs’ potentials regarding their substrate specificities. In order to characterize the squalene-hopene cyclases ZmoSHC1 and ZmoSHC2 and compare them with AacSHC especially regarding their biocatalytic activities towards unnatural substrates, the SHCs were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. Functional expression was confirmed by conversion of the natural substrate squalene. For the direct comparison, a protocol for partial purification of the membrane-anchored SHCs was elaborated and optimized. For this partial purification as well as for the conversion of the hydrophobic substrates in aqueous milieu a suitable detergent had to be selected. ZmoSHC1 was characterized in more detail, retrieving information about pH- and temperature-dependence of the activity and the biocatalytic stability over a long period of time as well as inhibitory effects. All of the three enzymes were tested with unnatural substrates of C10-C18 carbon chain lengths. A special focus was laid on substrates containing functional groups such as hydroxyl , carboxy- or keto-groups expected to participate in the cyclization reaction, as shown for the hydroxyl-group of homofarnesol. Several of the substrates were accepted and cyclic products were generated. Interestingly, the functional groups were integrated in the final ring closure and to products with new properties were obtained. Homofarnesol conversion yielding the cyclic ether ambroxan, which is known as a expensive and rare flavor compound, was observed as reported in the literature. Also the corresponding carboxylic acid, homofarnesoic acid, could be converted into the cyclic lactone sclareolide. The C15 tertiary alcohol nerolidol was accepted as substrate and the bicyclic ether caparrapioxide was formed. Lastly, two ketones were accepted as substrates leading to cyclic enol ether products. Within the present work, all of these new products were characterized after preparative biotransformation and product isolation. Not only the facts that these substrates are much shorter than the natural substrate squalene and possess different functional groups which take part in the cyclization reaction and that useful products containing new properties are formed, but also the different activities of the SHCs towards these substrates are remarkable. Thus, it could be shown that ZmoSHC1 exhibits special biocatalytic properties, as the substrate activity pattern was unexpected. While squalene was converted very poorly, good activity was found towards the reaction of homofarnesol to ambroxan. All of the other substrates were converted in low but significant rates into the corresponding cyclic products. A completely different substrate activity pattern was observed using AacSHC as biocatalyst. Besides very good squalene conversion, much lower activities towards all of the other substrates were found. Using ZmoSHC2, only very low conversion rates were found for squalene and farnesylacetone and no conversion of any of the other substrates. Based on these observations, it can be concluded that ZmoSHC1 represents a versatile biocatalyst for complex cyclization reactions, as it shows unexpected substrate activity towards other substrates than squalene. In the present work, these and further detailed results are described. Besides the examination of the SHCs’ activities towards different substrates there were also several mutants created in order to find explanations for the differences between the SHCs regarding their substrate activities. This characterization of the triterpenoid cyclase ZmoSHC1 and discussion of their special properties leads to new conclusions about the potential of SHCs to serve as potent biocatalysts for new reactions.
Open Access
Charakterisierung von Proteinen für die Biomineralisation von Hydroxylapatit
(2014) Melcher, Melanie; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die später in Mundpflegeprodukten Anwendung finden können. Hierfür wurden 24 unterschiedliche Proteine bezüglich ihrer Bindeeigenschaften und ihrer Nukleationsaktivität gegenüber Hydroxylapatit bewertet. Die Untersuchung der Bindeeigenschaften erfolgte, nach Fluoreszenzmarkierung der Proteine, über Messung der Fluoreszenzintensitäten und über Fluoreszenzmikroskopie. Neben den Bindeeigenschaften wurden die 24 Proteine bezüglich ihrer Nukleationsaktivität gegenüber Hydroxylapatit bewertet. Hierfür wurden zwei Assays aus der Literatur angepasst. Ein Konstrukt wurde für weitere detaillierte Untersuchungen durch ortsgerichtete Mutagenese gewählt. In dieser Arbeit konnte diese Sequenz, innerhalb eines Fusionsproteins, schrittweise in ein biologisch aktives Motiv (SD) aus der Natur zurückgeführt werden.
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Development of a chemoenzymatic (-)-menthol synthesis
(2018) Kreß, Nico; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Biocatalysis is an emergent research area for the development of efficient and sustainable synthesis processes. A crucial milestone for the better applicability of biocatalysts thereby consists of the increasing knowledge of the adaptability of enzymes for distinct synthetic needs like the conversion of specific molecular structures with defined selectivity. In addition, it is equally important to demonstrate that such novel catalysts are combinable among themselves and with established non enzymatic catalysts to enable unexplored synthetic routes. Using the example of the chemoenzymatic synthesis of (-)-menthol from citral, this work therefore addresses the development and applicability of such evolved enzyme catalysts for the synthesis of an industrially relevant molecule. In this complementary synthetic route inspired from an existing industrial process, a mixture of citral isomers is reduced to citronellal using an R-selective ene reductase. In a subsequent Prins reaction, the selective cyclization of R-citronellal to (-)-isopulegol is achieved by the application of an engineered squalene hopene cyclase variant. The final reduction to (-)-menthol proceeds by hydrogenation on a palladium catalyst. Especially the first catalytic step enables an immediate synthetic advantage in comparison to the currently performed industrial process. So far, no catalyst is applied converting both isomers of citral R-selectively at the same time. Both isomers have to be separated under high energy expenditure by distillation prior to reduction. No enzymatic catalyst is described displaying this reactivity yet. As, however, the opposite enantioconvergent S-selective citral reduction by ene reductases is known, the development of an enzyme catalyst constituted an attractive solution for this limitation. Hence, a focus of the work laid on the inversion of the S-selectivity of the citral reduction by NCR ene reductase from Zymomonas mobilis by enzyme engineering. The studies started by characterization of the citral reduction by NCR wild type. Next to the determination of the course of the reaction over time, semi empiric quantum mechanics calculations on the oxidative half reaction of this conversion were carried out. The calculations suggest a so far undescribed catalytic role of an arginine at position 224 for a facilitated hydride transfer and a more complex proton shift involving water molecules in the reaction. The subsequently performed engineering comprised the identification of selectivity determining amino acid positions W66, Y177, I231 and F269 in the active site of the enzyme followed by their variation in an iterative combinatorial fashion. In order to enable the analysis of the multitude of generated enzyme variants, a whole cell screening was developed using chiral gas chromatography. Thereby, the triple variant W66A/I231R/F269V was created converting E/Z-citral in the whole system to R-citronellal with an enantiomeric excess of 89 %. It could be determined that a cell induced citral isomerization leads to increased enantioselectivity in comparison to using purified enzyme. Especially for the influence of the selectivity determining positions W66 and I231 an increased understanding of structure function relations was achieved during the course of semi rational enzyme evolution by the separated analysis of single citral isomers and by supportive in silico analyses like docking and molecular dynamics simulations. The subsequent integration of the established variant A419G/Y420C/G600A of the squalene hopene cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius is remarkable catalyzing the Prins cyclization to (-)-isopulegol with an enantiomeric excess of 99 % and a diastereoselectivity of 90 %. In this context, the enzyme’s underlying Brønsted acid chemistry could be evolved towards the in nature unknown Prins reaction reactivity. In this work it could be shown that enzyme catalysts acquired by such chemical inspection can be implemented in application oriented synthetic routes. In combination with the developed selective ene reductase, the bienzymatic cascade to (-)-isopulegol was successfully performed and characterized. For the final reduction to (-)-menthol an established heterogeneous catalyst like palladium on charcoal could be applied under hydrogen atmosphere. This demonstrates nicely that novel biocatalysts can be combined with approved synthetic processes. With the attained insights, highly valuable (-)-menthol was made accessible for the first time by a chemoenzymatic cascade using an isomeric mixture of citral on preparative scale with 7 % isolated yield. This work not only highlights different strategies for the development of novel biocatalysts, but also contributes to their possible synthetic applicability in the synthesis of industrially relevant molecules.
Open Access
Development of acetylcholinesterase biosensors for neurotoxins detection in foods and the environment
(2011) Roepcke, Clarisse Brüning Schmitt; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Acetylcholinesterase (AChE) is responsible for the hydrolysis of acetylcholine in the nervous system. It is inhibited by several substances, like organophosphate and carbamate insecticides, glycoalkaloids, nerve gas and anatoxin-a(s). There is a growing need to develop new technologies to reduce time spent with sample preparation, discriminate between positive and negative samples, and to reduce analysis costs. Over the last decades, AChE biosensors have emerged as an ultra sensitive and rapid technique for toxicity analysis in environmental monitoring, food and quality control. Acetylcholinesterase is only slightly inhibited by organophosphorothionate insecticides, the most applied organophosphate insecticides worldwide. This fact makes their detection analytically very difficult. A new enzymatic method for the activation and detection of phosphorothionates was developed with the capability to be used directly in food samples without the need of laborious solvent extraction steps. Chloroperoxidase (CPO) from Caldariomyces fumago was combined with tert-butyl hydroperoxide and two halides. Chlorpyrifos and triazophos were completely oxidized. Fenitrothion, methidathion and parathion methyl showed conversion rates between 54 – 61%. Furthermore, the oxidized solution was tested with an AChE biosensor assay. Chlorpyrifos spiked in organic orange juice was oxidized, and its oxon product was detected in concentrations down to 5 µg/L (final concentration food sample: 25 µg/L). The complete duration of the method took about 2 h. An acetylcholinesterase B multisensor from Nippostrongylus brasiliensis (Nb) was developed to detect the most frequently used insecticides in Brazil. The objective was to establish a fast screening method, separating the negative samples from the positive ones. The four mutants, which together presented the widest sensitivity spectrum, were: F345A, M301A, W346V and W346A. The combination of these four mutants in a multienzyme biosensor array enabled the detection of 11 out of the 12 most important insecticides at concentrations below 20 µg/L. The biosensor test was compared with traditional analysis methods, and validated with food samples previously analyzed. The storage stability revealed that the biosensor remained stable for 40 weeks; however the sensitivity decreased with time. Glycoalkaloids are secondary metabolites present in potatoes, which can be toxic to humans in high concentrations. Alfa-Solanine and alfa-chaconine are the main examples of this group, and these substances show an anti-acetylcholinesterase activity. An Nb acetylcholinesterase B biosensor was designed to detect glycoalkaloids in buffer solutions and in foods. The two Nb AChE mutants that showed the highest sensitivity towards alfa-solanine and alfa-chaconine (lowest I50 value) were W303L and F345A. The Dixon and Cornish-Bowden plots demonstrated that the inhibition of these substances over Nb AChE was reversible and competitive. The achieved detection limits of alfa-chaconine and alfa-solanine were 0.1 and 0.5 µM, respectively. The designed biosensor was able to detect mixtures of alfa-solanine and alfa-chaconine in potatoes samples spiked with these glycoalkaloids in total concentrations higher than 300 µM.
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Engineering von Enzymtunneln : experimentelle Studie, in silico Modellierung und Simulation der Monooxygenase CYP153AM.aq
(2021) Rapp, Lea R.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Enzyme werden heutzutage als flexible und hochdynamische Makromoleküle und nicht mehr als statische Strukturen betrachtet. Daher ist das klassische Schlüssel-Schloss-Modell, das 1894 von Emil Fischer postuliert wurde, mittlerweile überholt. In neueren Betrachtungen wird die Flexibilität und auch die von Liganden induzierte Dynamik der Enzyme zusätzlich berücksichtigt. Es wurde gezeigt, dass gezielte Veränderungen der flexiblen Elemente von Enzymen die dominanten Konformationen des Proteins beeinflussen, was mitunter für eine effizientere Katalyse von Vorteil sein kann. Jedoch ist der Einfluss von gezielten Veränderungen durch Mutationen der dynamischen Bereiche, besonders von Enzymtunneln, aufgrund der geringen Konservierung von Aminosäuren meist schwierig vorherzusagen und rationale Ansätze aus diesem Grund bisher eine Seltenheit. Zur Vereinfachung wird daher immer noch oftmals mit den statischen Kristallstrukturen von Proteinen für das (semi-)rationale Enzym Engineering gearbeitet. Hinzu kommt, dass viele Enzyme ihr katalytisches Zentrum nicht nahe der Oberfläche ungeschützt präsentieren, sondern tief in der Proteinstruktur verbergen, um unspezifische katalytische Reaktionen auszuschließen und das aktive Zentrum zu schützen. In diesem Fall wird das „Schlüsselloch“ dem alten Modell hinzugefügt, das den Zugang des „Schlüssels“ zum „Schloss“ reguliert. Frühere (semi-)rationale Engineering Ansätze fokussierten sich hauptsächlich auf die aktive Tasche oder deren beeinflussende Aminosäuren in einer bestimmten Nähe zum katalytischen Zentrum oder des kristallisierten Liganden. Immer mehr an Interesse gewinnt innerhalb der Biokatalyse jedoch die Erforschung und Veränderung von weiter entfernten hochflexiblen Strukturelementen wie Loopregionen und molekulare Tunnel anstelle des aktiven Zentrums. Aktuelle Forschungen an Oberflächenloops zeigen, dass diese flexiblen Loopregionen zum Teil den Eingang wichtiger Substrattunnel bestimmen. Daher wurde im Zuge dieser Dissertation das Potenzial des Tunnel Engineerings am Beispiel der P450 Monooxygenase CYP153AM.aq aus dem Organismus Marinobacter aquaeolei VT8 untersucht. Das Prinzip des Tunnel Engineerings zur Verbesserung oder Umsetzung neuer enzymatischer Funktionen ist anerkannt, wird aber experimentell noch sehr wenig genutzt, obwohl prognostische Simulationen und retrospektive Aufklärungen existieren. Zu Beginn dieser Arbeit wurde das CYP153AM.aq System im Hinblick auf die in der Kristallstruktur vorhandenen Tunnel untersucht und eine erweiterte Analyse mit dem in silico Werkzeug CAVER durchgeführt. Dabei wurden drei Enzymtunnel identifiziert: Zwei putative Substrattunnel 2c und 2e und ein Solvent Tunnel S. In einer anfänglichen Mutagenesestudie wurden die Tunnel separat durch einzelne Substitutionen der strukturbildenden Aminosäuren hinsichtlich der Umsetzung verschiedener Substrate untersucht. Basierend auf den vorherigen Studien des Enzyms wurden diese Varianten auf die Spezifität hinsichtlich Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen (C8, C12 und C16) evaluiert. Da für diese Arbeit unter Anderem kürzerkettige Moleküle (C8) von Interesse waren, wurden aus der Klasse der Alkane n-Octan und zusätzlich das Alken trans-2-Octen getestet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Mutationen in den Tunneln 2c und 2e die Umsetzung und die Spezifität hinsichtlich verschiedener Substrate beeinflussen. Drei Positionen stachen dabei besonders hervor: M228 zeigte je nach Mutation Einfluss auf den Substratumsatz in Abhängigkeit von der Kettenlänge der Substrate, Q129 und V141 beeinflussten vor allem die Umsetzung kürzerkettiger Substrate. Werden diese Aminosäurereste in der Kristallstruktur betrachtet, fällt auf, dass sie ein Dreieck um den Tunnel 2c bilden und teilweise den Tunnel 2e begrenzen. Für die nachfolgende Mutagenesestudie an den oben genannten Aminosäuren wurde die Octansäure als Zielsubstrat gewählt. Besagte Reste wurden mittels Sättigungsmutagenese verändert und eine Variantenbibliothek erstellt. Um Varianten mit verändertem Produktspektrum zu identifizieren, wurde ein P450-Ganzzell-Screening auf Basis der indirekten Produktdetektion mittels Wasserstoffperoxid / HRP-vermittelter Oxidation des Farbstoffs ABTS angepasst. Mit drei unterschiedlichen semi-rationalen Mutagenese Ansätzen, die auf Struktur-Sequenz-Alignments der 3DM-Datenbank und Kristallstrukturen von CYP153AM.aq und dem homologen CYP153AP.sp basieren, wurden moderate Auswirkungen auf die Produktbildung erzielt. Durch die anschließende Kombination der besten Hits konnte eine Zweifach- (M.aqRT) und schließlich eine Dreifachvariante (M.aqRLT) generiert werden, die die effiziente ω-Hydroxylierung von Octansäure ermöglichen. M.aqRLT zeigte eine 151-fach verbesserte katalytische Effizienz und eine stark erhöhte Substratbindung (25-fach verringerter Km im Vergleich zum Wildtyp). Mithilfe von molekulardynamischen Simulationen konnten neue Erkenntnisse über die Dynamik des Enzyms gewonnen und aus den Mutationen resultierende Modifikationen der Tunnelstruktur verdeutlicht werden. Eine stark reduzierte Flexibilität und ein neuer Bottleneck des Tunnels 2c stellten sich als Hauptmerkmale der generierten Varianten heraus, die für die Stabilisierung des Enzym-Substrat-Komplexes und die Steigerung der katalytischen Effizienz verantwortlich sind. Die Interaktion des von S. Hoffmann beschriebenen Arginins als Fettsäureanker, Q129R, mit dem Carboxylat der Octansäure führt zu deren Stabilisierung in der reaktiven Konformation, wodurch die Aktivität der Variante M.aqRLT gegenüber Octansäure stark gesteigert wird. Durch die Generierung eines artifiziellen Fusionskonstrukts M.aqRLT-PFOR und der in vivo Vorausschaltung einer Thioesterase, die vermehrt Octansäure bildet, wurde die de novo Produktion von 129 ± 5 µM ω-Hydroxyoctansäure als Anwendungsbeispiel gezeigt. Im finalen Teil der Arbeit wurde durch gezieltes Engineering innerhalb der Tunnel die Substratpräferenz von CYP153AM.aq zu Dodecylamin, einem inhibierend wirkenden Fettamin, verändert. Um die Variantenbibliothek direkt aus 96-Deepwell Platten zu messen, wurde eine auf LC/MS-basierende Screeningmethode etabliert und angewendet. Durch die Umgehung einer chromatographischen Trennung der Analyten konnte die Messzeit erheblich, von 5,5 Minuten auf 36 Sekunden je Probe herabgesetzt werden. Während das verwendete Dodecylamin auf den Wildtypen als Inhibitor wirkt (IC50 = 0,9 µM) konnte durch gezielte Mutagenese an den in dieser Arbeit identifizierten Hotspots eine Variante, M.aqESE, generiert werden, die den bisherigen Inhibitor als ein neues Substrat akzeptiert (10 TON h-1). Durch das Einbringen von zwei Glutaminsäuren wurde die Aminogruppe im Tunnel fixiert und daran gehindert an das katalytisch aktive Eisen zu koordinieren, was den inhibierenden Effekt auslöst. Es zeigte sich, dass die generierten Varianten weniger durch das Amin gehemmt werden und gleichzeitig weniger affin zur Säure sind, da die Säuregruppe von den Glutaminsäureresten abgestoßen wurde. Im Verlauf dieser Arbeit konnte deutlich gezeigt werden, welche enormen Effekte durch Enzym Engineering an Tunnelstrukturen generiert werden können und welches Potenzial in der Kombination von experimentellen Versuchen und der computergestützten Modellierung und Simulation zum tiefergehenden Verständnis von Enzymen und Enzymkatalyse liegt.
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Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes
(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.
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Enzymatische Dehydratisierung kurzkettiger Alkenole
(2019) Fischer, Max-Philipp; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Open Access
Enzymatische Hydratisierung kurzkettiger Fettsäuren und Alkene
(2018) Demming, Rebecca M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
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Enzymatische und chemische Studien zur Veresterung und Löslichkeit von Cellulose in ionischen Flüssigkeiten
(2017) Hinner, Lars Pieter; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Cellulose ist der Hauptbestandteil der pflanzlichen Zellwand und daher die häufigste organische Verbindung auf unserem Planeten. Dieses nachwachsende Biopolymer wird heutzutage hauptsächlich für die Produktion von Papier und Zellstoff verwendet oder verbrannt und somit als billiger Energieträger genutzt. Viele alternative Anwendungsgebiete sind aufgrund von unzureichenden Materialeigenschaften schwierig zu realisieren. Insbesondere thermoplastische Anwendungen sind nicht durchführbar, da Cellulose keinen Schmelzpunkt besitzt. Auch die chemische Modifikation der Cellulose - mit dem Ziel, andere Materialeigenschaften zu generieren - ist schwierig, da Cellulose nicht in Wasser oder in üblichen organischen Lösungsmitteln gelöst werden kann. Bis dato wurden daher industriell heterogene Synthesen entwickelt, um Cellulose im nicht gelösten Zustand zu modifizieren. Hierbei sind allerdings aufwendige mechanische und chemische Vorbehandlungen notwendig, um eine effiziente Verarbeitung bzw. Modifizierung der Cellulose zu gewährleisten. Zusätzlich sind heterogene Synthesen zur Produktion von Celluloseestern, aufgrund der starken sterischen Hinderung der nicht gelösten Cellulose, auf kurzkettige Acyldonoren (C2-C4) beschränkt. Somit ist es mit heterogenen Prozessen nicht möglich, das komplette Spektrum an potenziellen Celluloseestern zu erzeugen. Es gibt allerdings ein steigendes Interesse an neuartigen Celluloseestern, da beispielsweise Celluloseacetat nur eine schlechte thermoplastische Prozessierbarkeit aufweist. Die Herstellung von neuartigen Celluloseestern kann in homogenen Synthesen besser realisiert werden, in denen Cellulose vollständig gelöst vorliegt. Als Reaktionsmedium können unter anderem spezielle ionische Flüssigkeiten genutzt werden, welche in der Lage sind, Cellulose zu lösen. In diesem Kontext wurden verschiedene Synthesen entwickelt, welche reaktive Acyldonoren verwenden. Der Einsatz von derartigen Acyldonoren, wie beispielsweise Carbonsäurechloriden ist allerdings problematisch, da diese sowohl das Cellulosegrundgerüst, als auch die ionische Flüssigkeit zersetzen können. Daher erscheint eine homogene enzymatische Synthese von Celluloseestern als interessante Alternative, da durch die Verwendung von enzymatischen Katalysatoren weniger reaktive Acyldonoren, wie beispielsweise Ester, genutzt werden können. Angesichts der Herausforderung, unter moderaten Bedingungen zu katalysieren, lag ein Fokus der hier vorgelegten Arbeit in der Entwicklung einer enzymatischen Synthese von Celluloseestern mit langen Seitenketten. Da die Analytik von niedrig substituierten Celluloseestern schwierig ist, wurden zunächst leichter zu analysierende Modellreaktionen untersucht. Einfache Veresterungs- und Umesterungsreaktionen können in Cellulose-lösenden ionischen Flüssigkeiten erfolgreich enzymatisch katalysiert werden. Die enzymatische Synthese von Glucoseestern war jedoch nur in ionischen Flüssigkeiten erfolgreich, welche Cellulose nicht lösen. Als möglicher Grund hierfür wird eine mangelnde Interaktion zwischen Enzym und Glucose in diesen polaren ionischen Flüssigkeiten postuliert. Um die Interaktion zwischen Enzym und Glucose zu steigern, wurde die Glucosekonzentration erhöht, was allerdings zu keiner erfolgreichen Synthese von Glucoselaurat führte, da die große Viskosität von hoch konzentrierten Zuckerlösungen den Massentransfer und damit die Reaktion zusätzlich inhibiert. Eine Steigerung der Interaktionswahrscheinlichkeit zwischen Enzym und Glucose durch die Erhöhung der Glucosekonzentration ist allerdings in dem ebenfalls polaren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) erfolgreich und erzeugt ab einer Glucosekonzentration von 60 % w/v signifikante Mengen an Glucoselaurat. Um sich in einem nächsten Schritt an den polymeren Charakter der Cellulose weiter anzunähern, wurde die enzymatische Veresterung des Dimers der Cellulose, d.h. der Cellobiose, als weitere Modellreaktion untersucht. Hierbei katalysiert das Enzym Candida antarctica Lipase B (CAL-B) die Synthese von nur sehr geringen Mengen an Cellobioseestern, wobei andere, ebenfalls aus Glucose aufgebaute Disaccharide wie Maltose und Trehalose, deutlich besser umgesetzt werden. Neunzehn verschiedene Enzympräparationen wurden auf die Fähigkeit untersucht, Cellobioselaurat zu synthetisieren. Den höchsten Umsatz katalysiert die Schweineleberesterase (PLE), jedoch zeigte dieses Enzym keine Aktivität gegenüber Cellulose als Ausgangssubstrat. Neben der enzymatischen Katalyse wurde eine chemische Synthese, basierend auf Vinylestern, entwickelt. Diese Vinylester-basierte Synthese ermöglicht erstmals die Acylierung von Cellulose mit Vinylestern in der biologisch abbaubaren ionischen Flüssigkeit 1-Ethyl-3-methylimidazoliumacetat ([EMIM]OAc). Die Reaktion läuft in Abwesenheit von zusätzlichen Katalysatoren ab und erlaubt die Synthese von Glucoseestern und Celluloseestern mit unterschiedlich langen Seitenketten. Es war möglich, Celluloseester mit Substitutionsgraden von 0,24 bis 3,00 zu erzeugen. Um die Reaktion zu charakterisieren, wurden verschiedene Reaktionsparameter wie Reaktionszeit, Temperatur und die Menge an Acyldonor systematisch variiert und mittels 1H-NMR, FT-IR und HPLC-GPC analysiert. Der höchste Veresterungsgrad ergibt sich bei einer Synthese-temperatur von 80°C und einer Reaktionszeit von zwei Stunden. Um die Synthese mit anderen Reaktionen aus der Literatur zu vergleichen, wurde eine Fettsäurechlorid-basierte Synthese von Barthel und Heinze in der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-methylimidazoliumchlorid ([BMIM]Cl) reproduziert. Beide Reaktionen zeigen vergleichbare Substitutionsgrade (DS), jedoch ist der Polymerisationsgrad (DP) von Celluloselaurat nach der Fettsäurechlorid-basierten Synthese erheblich reduziert, während die Vinylester-basierte Synthese deutlich schonender ist und die Produktion von signifikant größeren Celluloseestern erlaubt. Bei der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc wurde eine zusätzliche Acetylierung der Cellulose als unerwünschte Nebenreaktion identifiziert. Der Acetylierungsgrad steigt mit abnehmender Polarität und steigender sterischer Hinderung der eingesetzten Vinylester. Allgemein ist der Acetylierungsgrad nach der Vinylester-basierten Synthese in [EMIM]OAc allerdings deutlich niedriger als bei bereits beschriebenen Synthesen in [EMIM]OAc, welche Anhydride oder Fettsäurechloride als Acyldonoren nutzen. Das Produktspektrum der Vinylester-basierten Synthese konnte durch Verwendung zusätzlicher Acyldonoren wie Benzoesäurevinylester, Pivalinsäurevinylester, Neodecansäurevinylester und 2-Ethylhexansäurevinylester erfolgreich erweitert werden. Des Weiteren wurden die thermoplastischen und rheologischen Eigenschaften der Celluloseester im Rahmen einer Kooperation mit Linda Göbel vom Institut für Kunststofftechnik untersucht, wobei die thermoplastische Verarbeitbarkeit prinzipiell bestätigt wer-den konnte. Es wurde außerdem ein Upscaling der Synthese mit anschließendem Recycling der ionischen Flüssigkeit durchgeführt. Das Upscaling wurde in einem Laborreaktor mit 2,5 kg ionischer Flüssigkeit durchgeführt, wobei 233,25 g Celluloselaurat mit einem Substitutionsgrad von 2,3 synthetisiert werden konnte. Die ionische Flüssigkeit wurde mit einer durchschnittlichen Effizienz von 91 % w/w recycelt und konnte in einer nach-folgenden Synthese als Lösungsmittel eingesetzt werden. Insgesamt wurden drei Synthese-Recyclingzyklen durchgeführt, wobei der Substitutionsgrad nach den ersten zwei Synthesen bei 2,3 lag, bei der dritten bzw. vierten Synthese allerdings auf 1,8 bzw. 1,4 sank. Parallel zur Verringerung des Substitutionsgrades verkürzte sich die Lösezeit von Cellulose in der ionischen Flüssigkeit mit jedem weiteren Recyclingzyklus signifikant. Als Grund für die verbesserte Löslichkeit wurde die Bildung von 1-Ethyl-2-hydroxyethyl-3-methylimidazolium (EHEMIM) identifiziert, das durch die Reaktion einer Carben-Spezies des 1-Ethyl-3-methylimidazoliums (EMIM) mit Acetaldehyd - welches als Nebenprodukt bei der Vinylester-basierten Synthese auftritt - entsteht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein von Wasser für das verbesserte Lösungsvermögen des [EHEMIM]-[EMIM]OAc-Systems essentiell ist. Die besten Lösungseigenschaften wurden bei einem Kationenanteil von 50 mol-% EHEMIM bzw. 50 mol-% EMIM und einem Wassergehalt von 8,5 % w/w beobachtet. Dieses optimierte [EHE-MIM]-[EMIM]OAc-Wasser-System ermöglicht das Lösen von 14 % w/w Cellulose bei 80°C innerhalb von 3 Stunden. Im Gegensatz dazu löst die ursprüngliche ionische Flüssigkeit [EMIM]OAc bzw. [EMIM]OAc mit einem optimalen Wassergehalt von 10 % w/w unter den gleichen Bedingungen lediglich 1 % w/w bzw. 2 % w/w Cellulose.
Open Access
Enzymatischer Zugang zu mittelkettigen Dicarbonsäuren
(2014) Otte, Konrad B.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem alternativen biotechnologischen Zugang zu den interessanten Polymerbausteinen Azelainsäure und Sebacinsäure. Ausgehend von Linolsäure wird Azelainsäure in einer dreistufigen Multienzymkaskade hergestellt, welche auf dem pflanzlichen Oxylipinmetabolismus basiert. Die oxidative Spaltung wird durch eine 9-Lipoxygenase (St-LOX1, Solanum tuberosum) eingeleitet, welche Linolsäure mit molekularem Sauerstoff hydroperoxidiert. In einer Folgereaktion wird das entstandene 9-Hydroperoxid durch eine 9/13-Hydroperoxid-Lyase (Cs-9/13HPL, Cucumis sativus) in ein Aldehyd und eine 9-Oxosäure gespalten. In einem letzten Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) katalysierten Schritt wird die 9-Oxosäure 9-Oxononansäure zu Azelainsäure oxidiert. Der hierauf basierende entwickelte E. coli Stamm konnte, in einer Eintopfreaktion Linolsäure direkt zu Azelainsäure umzusetzen (29 mg/mL innerhalb von 8 h). Für die Herstellung von Sebacinsäure wurde mittels einer retrosynthetischen Analyse eine vierstufige artifizielle Multienzymkaskade, ausgehend von Ricinolsäure, entwickelt. Die zentrale C-C-Bindungsspaltung dieser Kaskade erfolgt durch eine de novo Retro-Aldolase (RA 110.4, Arzeda) katalysierte Reaktion. Das für diese Reaktion benötigte 1,3-Ketolmotiv wird zuvor in einer zweistufigen Enzymkaskade bereitgestellt. In einem ersten Schritt wird Ricinolsäure mittels einer Alkohol-Dehydrogenase (ADH-102, c-LEcta) zu 12-Oxoölsäure oxidiert und anschließend mit einer Oleat-Hydratase (Em-OAH1, Elizabethkingia meningoseptica) zu 10-Hydroxy-12-oxostearinsäure umgesetzt. Die durch die Retro-Aldolreaktion entstehende 10-Oxodecansäure wird in einem letzten Schritt analog zu der Oxidation von 9-Oxononansäure mithilfe einer Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) zu Sebacinsäure oxidiert. Die in vitro Multienzymkaskade konnte innerhalb von 26 h mit einer Gesamtausbeute von 10 % durchgeführt werden.