Browsing by Author "Payer, Edina"

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    Mikrobielle Herstellung von cis-Dihydrodihydroxybenzoaten als Bausteine für die chemische Synthese
    (2002) Payer, Edina; Knackmuss, H.-J. (Prof. Dr.)
    Ziel dieser Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren für die Herstellung von Phenol aus Toluol zu entwickeln. Das Verfahren sollte aus einem biologischen und aus einem chemischen Schritt bestehen. In dem biologischen Schritt sollte aus Toluol Dihydrodihydroxybenzoat (cis-cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol-1-carboxylat) produziert werden, welches in einem Folgeschritt durch Ansäuren zu Phenol umgewandelt werden kann. Für den biologischen Prozess stand am Anfang dieser Arbeit noch kein Bakterienstamm zur Verfügung, der Toluol zu DHB umzusetzen konnte. Deshalb wurde zunächst ein Verfahren entwickelt, bei dem in Fedbatch-Fermentationen mit Ralstonia eutropha B9 aus Benzoat als Ausgangssubstrat DHB in hohen Produktkonzentrationen hergestellt werden konnte (300 mmol·l-1). Dieser Benzoat-Verwerter ist im Benzoat-Katabolismus an der Stelle der Benzoat-Dehydrogenase blockiert. Wichtig hierfür war, dass die Phosphatpufferkonzentration des Mediums von 50 mmol·l-1 auf 1 mmol·l-1 reduziert wurde. Außerdem war die Verwendung eines Auxiliarsubstrats wichtig, dessen Abbau keine pH-Änderung während des Prozesses verursachte. Bei dieser relativ hohen Produktkonzentration ist es möglich geworden, durch eine einfache Aufarbeitungsmethode (Fällung mit Isopropanol) Na-DHB am Ende der Fedbatch-Fermentation in reiner kristalliner Form zu isolieren. Dieser zweistufige Prozess konnte auch erfolgreich zur Herstellung substituierter DHBs angewendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf industrieller Nachfrage 4-Fluor-DHB, 3,5-Difluor-DHB, 3-Methyl-DHB, 4-Methyl-DHB, 3,4-Dimethyl-DHB und 4-Chlor-DHB im 1 bis 5 g Maßstab und DHB im 60 g Maßstab produziert. Mit dem Stamm Ralstonia eutropha B9 wurden die fluorierten DHB hergestellt. Die methyl-substituierten DHB wurden mit einem von Whited et al. (1986) beschriebenen Stamm, Pseudomonas putida BGXM1, produziert. Für die Produktion von 4-Chlor-DHB kam der von A. Germer (Institut für Mikrobiologie, Universität Stuttgart) konstruierte Stamm Pseudomonas putida Idaho BDH2 zum Einsatz. Dieser Stamm zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass er Toluol zu DHB umsetzen kann. Die genetische Veränderung bestand in der Blockierung zweier DHB-Dehydrogenasen. Dieses Konstrukt wurde im Hinblick auf einen technischen Prozess näher untersucht. Nach Angaben von A. Germer konnte DHB mit einer Ausbeute von 25-40 % aus Toluol gewonnen werden, wenn Toluol als alleiniges Substrat bzw. Cosubstrat verwendet wurde. Bei einer weiteren Kultivierung (etwa 4 Tagen) wurde das entstandene DHB unter Bildung von Biomasse wieder abgebaut. Im Rahmen dieser Arbeit ist es lediglich gelungen 4 % DHB aus Toluol zu bilden und zwar mit sogenannten "Ruhezellen" von Pseudomonas putida Idaho BDH2. Diesen "Ruhezellen" wurde allerdings sowohl Glucose als auch Mineralsalze zugesetzt wurden. Wurde bei diesen Experimenten nur Toluol verwendet, war eine noch geringere Umsatzrate und eine noch niedrigere Ausbeute an DHB festzustellen. Deutlich höhere Ausbeuten an DHB (70%) wurden mit dem 4-Methylbenzoatverwertenden Stamm Pseudomonas putida BGXM1 erhalten. Dieser ist in der 4-Methylbenzoat-Katabolismus an der Stelle der 4-Methylbenzoat-Dehydrogenase blockiert. Für diesen Stamm, der ursprünglich für die Herstellung von Methyl-substituierten DHB eingesetzt wurde, konnte nachgewiesen werden, dass er DHB aus Toluol bildet. Allerdings war trotz identischer Anzucht- und Reaktionsbedingungen die Ausbeute von DHB stark vom Zustand der Zellen abhängig. Als Fazit der Untersuchungen ist festzustellen, dass die Herstellung von Phenol aus Toluol prinzipiell möglich ist. Die im Rahmen der Arbeit untersuchten Bakterienstämme, die Toluol zu DHB oxidieren, sind für einen technischen Prozess jedoch wenig geeignet. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte Methode zur Herstellung von DHB kann durchaus für einen technische Einsatz z.B. für die Herstellung von Synthonen und Feinchemikalien verwendet werden.