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Open Access
Expression, Charakterisierung und Optimierung mikrobieller Laccasen für die Biokatalyse
(2008) Koschorreck, Katja; Schmid, Rolf D. (Prof.)
Laccasen (E.C. 1.10.3.2.) gehören zu den Multikupferoxidasen und katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substratmolekülen durch die Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Besonders aus Weißfäulepilzen wurden viele Laccasen beschrieben und in der Biokatalyse eingesetzt. Bisher wurden jedoch hauptsächlich natürlich vorkommende Mischungen von Laccasen aus Weißfäulepilzen und nicht isolierte Enzyme verwendet. In der vorliegenden Arbeit sollten deshalb Laccasen aus verschiedenen Mikroorganismen exprimiert und charakterisiert sowie auf ihre Einsetzbarkeit in der Biokatalyse untersucht werden. Die Aktivität der Laccasen bei der oxidativen Kupplung phenolischer Säuren sowie der Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe stand dabei im Vordergrund. Zudem sollte die häufig geringe Expression der Laccasen verbessert und gemeinsam mit der Aktivität der Enzyme über gezielte Mutagenese oder Zufallsmutagenese gesteigert werden. Vier verschiedene Laccasen aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor, Lccalpha, Lccbeta, Lccgamma und Lccdelta, wurden erfolgreich in Pichia pastoris überexprimiert. Die Wahl der Signalsequenz zur Sekretion in P. pastoris sowie die Temperatur hatten einen großen Einfluss auf die Expression der Laccasen. Durch Hochzelldichte-Kultivierungen von P. pastoris wurden hohe Ausbeuten der Laccasen von bis zu 3400 U l–1 erzielt, die den biotechnologischen Einsatz dieser Enzyme realisierbar machen. Die biochemische Charakterisierung der Laccasen ergab, dass Lccalpha und Lccbeta bei Raumtemperatur wie auch bei höheren Temperaturen deutlich stabiler als Lccgamma und Lccdelta waren. Zudem zeigten die Laccasen sehr unterschiedliche katalytische Aktivitäten. Obwohl alle vier Isoenzyme die oxidative Phenolkupplung von 5 mM Sinapinsäure regioselektiv zum Dehydrodisinapinsäuredilakton katalysierten, zeigte Lccdelta mit 98% Umsatz nach 20 min die höchste Aktivität. Lccalpha, Lccbeta und Lccgamma wiesen nach 20 min 34%, 50% bzw. 48% Umsatz auf. Die Oxidation polyzyklischer aromatischer Kohlenwasser-stoffe erfolgte hingegen am effektivsten mit Lccbeta. Durch Einsatz des Redoxmediators 2,2-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-Schwefelsäure) (ABTS) wurde mit Lccbeta nach 72 h über 80% Umsatz von 0,1 mM Anthracen, Acenaphthen und Acenaphthylen erzielt und damit deutlich bessere Ergebnisse erreicht als bisher mit Laccase-Mischungen aus T. versicolor und ABTS. Lccbeta wurde somit als stabilste Laccase aus T. versicolor mit hoher Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten identifiziert und ist potenziell für einen Einsatz in der Biokatalyse geeignet. Strukturelle Analysen der Laccasen und anschließende Mutagenese zeigten, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der Laccasen gegenüber polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen durch die Aminosäuren an Position 164 und 265 in der Substratbindetasche verursacht werden. Des Weiteren wurde eine neue Laccase aus Bacillus licheniformis identifiziert und erfolgreich in Escherichia coli überexprimiert. Das Enzym CotA katalysierte die oxidative Kupplung verschiedener phenolischer Säuren, allerdings war die Aktivität des Enzyms stark von der Alkylkettenlänge der Säureseitengruppe wie auch von den Substituenten in ortho-Position der Phenolgruppe abhängig. So wurden 5 mM Sinapinsäure, Kaffeesäure und Ferulasäure von CotA nach 120 min zu 66%, 22% bzw. 15% umgesetzt, während p-Cumarsäure, Zimtsäure und Vanillinsäure nicht oxidiert wurden. Als Hauptprodukte der Kupplungsreaktionen wurden Dimere der Säuren identifiziert. Die höchste Regioselektivität bei der oxidativen Phenolkupplung wurde bei der Oxidation von Sinapinsäure zum Dehydrodisinapinsäure-dilakton erreicht (79% Anteil am Gesamtprodukt). Syringasäure wurde von CotA ausschließ-lich zum 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinon oxidiert (22% Umsatz nach 120 min). CotA wurde durch Zufallsmutagenese (error-prone PCR) verändert und 6000 CotA-Varianten im Hochdurchsatzverfahren auf verbesserte Aktivität gegenüber ABTS untersucht. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurde anschließend über einen rationalen Ansatz die CotA-Variante K316N/D500G erzeugt. Diese konnte 11,4-mal so stark wie der Wildtyp exprimiert werden. Das bedeutet, dass circa 300 mg aktive Laccase aus 1 l E. coli-Kultur erhalten werden können. K316N/D500G zeigte zudem eine um circa 50% höhere spezifische Aktivität bei der oxidativen Phenolkupplung von Ferulasäure als der Wildtyp. Die Aktivität gegenüber Kaffeesäure war leicht erhöht (20% Umsatz gegenüber 18% Umsatz mit CotA). Außerdem wurden die Farbstoffe Remazol Brilliant Blue R, Alizarin Red S und Indigocarmin von K316N/D500G sowohl in An- wie in Abwesenheit des Redoxmediators Violursäure deutlich stärker entfärbt als von CotA-Wildtyp. Die verbesserten Eigenschaften der CotA-Variante K316N/D500G ermöglichen den Einsatz dieser bakteriellen Laccase in der Biokatalyse.
Open Access
Molekularbiologische und prozesstechnische Optimierung der P450BM-3 basierten Ganzzellbiotransformation von alpha-Pinen im wässrig-organischen Zweiphasenprozess
(2009) Schewe, Arnd Hendrik; Schmid, Rolf D. (Prof.)
Im Zentrum dieser Arbeit stand die Entwicklung eines wässrig-organischen Zweiphasenpro-zesses zur regio- und stereoselektiven Ganzzellbiotransformation eines apolaren und toxischen Terpens zu hochwertigen Produkten. Die Fünffachvariante V26T R47F A74G F87V L188K der katalytisch unabhängigen P450-Monooxygenase CYP102A1 (P450BM 3 QM) und das bizyklische Monoterpen (-)-alpha-Pinen wurden als Modellenzym bzw. –terpen verwendet, um die mikrobielle Ganzzellbiotransformation durch rekombinante Escherichia coli BL21 (DE3) Zellen zu untersuchen. Dabei konnten Produktausbeuten und Produktend-konzentrationen des wässrig-organischer Zweiphasenbioprozess sowohl durch prozesstechni-sche als auch molekularbiologische Optimierungen verbessert werden. P450BM 3 QM oxidiert in einer cofaktorabhängigen Reaktion (-)-alpha-Pinen zu (-)-alpha-Pinenoxid, (-)trans-Verbenol und (-)-Myrtenol mit einem Enantiomerenüberschuß >92%. Verbenol und Myrtenol fördern die Entkopplung der NADPH-Oxidation von der Substratoxidation und hemmen dadurch P450BM 3 QM kompetitiv. Zusätzlich zu diesem Phänomen machte die Instabilität von alpha-Pinenoxid in wässriger Lösung eine interne in situ Produktabtrennung durch Extraktion in eine organische Trägerphase, die im direkten Kontakt mit dem Ganzzellbiokata-lysator steht und gleichzeitig als Substratreservoir dient, notwendig. Im Erlenmeyerkolben mit reinem (-)-alpha-Pinen als organische Phase konnten einige prozessrele-vante Parameter, wie toxische Einflüsse einer alpha-Pinenphase auf E. coli, identifiziert werden. Durch Expression eines Glucosefacilitators (GLF) aus Zymomonas mobilis und einer Glucosedehydrogenase (GlcDH) aus Bacillus megaterium konnte ein, auf extrazellulär vorliegender Glucose basierendes, intrazelluläres Cofaktorregenerationssystem eingeführt werden und dessen positiver Einfluss auf die spezifische Produktausbeute YP/X und die spezifische initiale Produktbildungsrate Q beschrieben werden. Bei Verwendung eines Ganzzellbiokatalysators mit rekombinanter Cofaktorregenerierung konnte YP/X um das Sechs- und Q um das Neunfache gesteigert werden. Bei der prozesstechnischen Optimierung des Zweiphasenbioprozesses konnte, durch Einführung von Diisononylphthalat (DINP) als organische Trägerphase für das Substrat alpha-Pinen, eine Verbesserung der Biokompatibilität der organischen Phase und dadurch eine Verlängerung des Produktbildungszeitraums auf über 4 h erreicht werden. Weitere prozessrelevante Parameter wie Rührerdrehzahl, Volumen der organischen Phase und Anteil des Substrats alpha-Pinen in der organischen Phase wurden identifiziert und optimiert. Die Kombination prozesstechnischer und molekularbiologischer Optimierungen führte zu bisher in der Literatur nicht beschriebenen Konzentrationen für die biokatalytische Oxidation von alpha-Pinen von über 1 g l 1 oxidierte Produkte bezogen auf das Volumen der wässrigen Phase nach 4 h Biotransformationszeit. Diese Produktausbeuten stellen einen weiteren Schritt zur Etablierung industrieller Verfahren zur biologischen Wertschöpfung auf Basis von Terpenen dar.