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Das Kinetochorprotein Slk19 : Funktion und Interaktion mit der proteasomalen Untereinheit Pre4
(2005) Schmidt, Joachim; Hilt, Wolfgang (Priv. Doz. Dr.)
In dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen Slk19 und Pre4 durch biochemische und genetische Experimente zu untermauern und die Bedeutung dieser Wechselwirkung näher zu untersuchen. In einem genetischen Ansatz wurde versucht, mutierte pre4 Allele zu isolieren, bei denen die mögliche Wechselwirkung zwischen Pre4 und Slk19 blockiert ist. Dafür wurde der Effekt der synthetischen Letalität, der bei der Kombination von SLK19 Deletion mit der KAR3 Deletion auftritt, ausgenutzt. Tatsächlich konnte in einem Klon durch ein pre4 Mutantenallel (pre4-72), das durch mutagene PCR erzeugt worden war, Letalität hervorgerufen werden, die nur in Kombination mit der Deletion von KAR3 auftrat. Dieses Verhalten konnte durch Plasmidaustausch (Umschalten von PRE4 Wildtyp nach pre4-72) in KAR3 Wildtyp Zellen und kar3 Nullmutanten verifiziert werden. Die Analyse der pre4-72 Sequenz ergab drei Punktmutationen im PRE4 ORF. Davon liegt eine N20K (Position 20 der Pro-Sequenz von Pre4) in dem durch Prozessierung entfernten N-terminalen Bereich; zwei Mutationen M52L und M142K verbleiben in der prozessierten Form von Pre4. Untersuchungen zur Lokalisierung der Punktmutationen von prozessiertem Pre4 im Proteasomenkomplex unter Verwendung von Röntgenstrukturdaten des 20S Proteasoms zeigten, dass sich die beiden Mutationen M52L und M142K in Furchen bzw. Taschen des Proteasomenkomplexes befinden und somit in Strukturen, die potentiell der Interaktion mit Slk19 zugänglich sind. Messungen der proteolytischen Aktivität des Proteasoms in pre4-72 Mutanten zeigten gegenüber pre4-1 Mutanten keinen Defekt in der PGPH Aktivität. Aus Experimenten in denen die einzelnen Punktmutationen von pre4-72 getrennt kontrolliert wurden, ging hervor, dass der synthetisch letale Effekt erst durch Kombination beider Punktmutationen M52L bzw. M142K hervorgerufen wurde; bei der Kombination der Einzelmutationen mit kar3D und als Kontrolle mit KAR3 Wildtypzellen traten lediglich von Kar3 unabhängige Wachstumsdefekte auf. Die Untersuchung der Einzelmutanten zeigte außerdem, dass das generelle Kar3 unabhängig auftretende Wachstumsdefizit von pre4-72 Mutanten durch die Punktmutation M142K ausgelöst wird. Bei „Two-Hybrid“-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass bei mutiertem Pre4-72 Protein tatsächlich die Wechselwirkung zu Slk19 stark beeinträchtigt oder blockiert ist. Damit konnte ein weiterer Beweis für die direkte Wechselwirkung zwischen Slk19 und Pre4 erbracht werden. In Zellen mit pre4-72 Hintergrund wurden außerdem phänotypische Untersuchungen zu möglichen Störungen der Mitose und Meiose durchgeführt. Im Gegensatz zu slk19 Nullmutanten konnte für pre4-72 Zellen keine oder wenn überhaupt nur eine nicht signifikant erhöhte Rate der Bildung von Dyaden anstatt Tetraden in der Meiose nachgewiesen werden. Bei Untersuchungen zur Stabilität von artifiziellen Chromosomen war im Gegensatz zu slk19 Nullmutanten in pre4-72 Mutanten nur ein schwach erhöhter aber dennoch signifikanter Verlust an artifiziellen Chromosomen im Verlauf der mitotischen Teilung festzustellen. Aber zumindest übt pre4-72 einen negativen Einfluss auf das Wachstum von Hefezellen aus. Plasmidabhängige pre4-72 Zellen wachsen deutlich langsamer als Wildtypzellen. Beim Versuch der Integration des pre4-72 Allels an den chromosomalen PRE4-Lokus konnten mit verschiedenen Strategien nur Zellen erhalten werden, bei denen die PRE4 Wildtyp Sequenz wiederhergestellt war. Dieses Phänomen ist ein starkes Indiz dafür, dass chromosomal integriertes pre4-72 offensichtlich drastische Nachteile für die Zelle hervorruft. Immunopräzipitationsexperimente zur Klärung der Frage, ob Slk19 nur mit Pre4 oder dem gesamten Proteasomenkomplex interagiert, hatten in vorangegangenen Arbeiten keine eindeutigen Ergebnisse erbracht. Zur Klärung dieses Problems sollten deshalb Co-Immunopräzipitationsversuche mit HA-markiertem Slk19 nun unter Verwendung von Protein-A-markiertem Pre6 durchgeführt werden, um einen biochemischen Nachweis für die direkte Wechselwirkung von Slk19 mit dem Proteasom zu erhalten. Im Immunopräzipitat von 20S Proteasomen aus nativen Extrakten synchronisierter Zellen unter Verwendung von Pre6-ProtA als antigene Determinante war es möglich, Slk19(HA)3 Signale nachzuweisen. Dieses Ergebnis zeigt, dass Slk19 mit dem Proteasom interagiert. Eine erste Analyse der gefundenen Slk19(HA)3 Signale mit den im Verlauf des Zellzyklus wechselnden Modifikationen von Slk19(HA)3 in durch alkalische Lyse erhaltenen Extrakten lassen zumindest annehmen, dass die Wechselwirkung zwischen Slk19 und dem Proteasom zellzyklus-abhängig reguliert ist. Diese Arbeit konnte einerseits das Modell, dass Slk19 mit dem Proteasomenkomplex interagiert bestätigen. Andererseits weisen die Ergebnisse auf eine Funktion der Wechselwirkung zwischen Slk19 und Pre4 hin, die unabhängig von bekannten Funktionen von Slk19 ist, aber trotzdem während der Mitose und Meiose eine Rolle spielt.