03 Fakultät Chemie
Permanent URI for this collectionhttps://elib.uni-stuttgart.de/handle/11682/4
Browse
46 results
Search Results
Item Open Access Development of a diagnostic microarray for the rapid detection of extended spectrum beta-lactamases for the use in clinical microbiology(2005) Grimm, Verena Ulrike; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Among the most important types of resistances to be detected are the extended spectrum beta-lactamases (ESBLs). ESBLs are found in many different species of the family Enterobacteriacae. Most ESBLs are mutants of TEM- or SHV-type beta-lactamases. The TEM- and SHV- subtypes are derived from parental sequences (TEM-1, SHV-1) and differ from them by a variable number of amino acid substitutions. These mutations lead to an extended spectrum of activity against newer lactams, especially against 3rd generation cephalosporins. Other derivatives of the classical TEM or SHV enzymes also show an inhibitor resistant TEM (IRT) phenotype conferring resistance to beta-lactamase inhibitors. ESBL producing organisms are difficult to detect in standard phenotypic screening tests, mainly because of their widely varying levels of activity against various cephalosporins. For an improved accuracy confirmatory susceptibility tests have to be performed resulting in a response time of three days until the ESBL phenotype can be identified unequivocally. Since infections with ESBL producing organisms are registered with increased prevalence and are associated with significantly longer hospital stays and higher costs, more accurate tests to detect ESBLs in clinical isolates are necessary. The microarray technology allows the genotypic identification of resistance traits in less than one day of analysis time. Furthermore, the identification of the beta-lactamase variant on a molecular level will define for most ESBL isolates a specific substrate pattern, which can be considered for the determination of the appropriate antibiotic treatment. Additionally, the genotyping of resistances can be used for the reliable surveillance of multiresistant bacteria in wards or hospitals. In the present study a diagnostic microarray was developed for the rapid identification of mutations of the majority of the currently known TEM or SHV beta-lactamase variants, which are related to the ESBL and/or IRT phenotype. The assay enabled the detection and identification of 99 % of the relevant polymorphisms for TEM beta-lactamases and 100 % of the mutations of SHV beta-lactamases. This allows the detection of 96 % of the currently known TEM-variants and 100 % of the known SHV-variants. Consensus primers were developed and used for target amplification covering the majority of the known variant sequences. The sensitivity, reproducibility and identification capability of the developed arrays was determined with a set of reference samples. Furthermore, the TEM-array was validated by testing 72 clinical isolates collected in diverse institutions in Germany, Croatia and Russia. The SHV-array was validated by testing 30 clinical isolates collected in Croatia. The simultaneous detection of an extended spectrum-variant in presence of a narrow spectrum-variant was shown in a model system for TEM up to a ratio of 1:10, as well as in clinical isolates for SHV. Starting from the isolated DNA, the assay could be performed in less than 3.5 hours. The discrimination level, the sensitivity and the reproducibility were enhanced by automation of the hybridization procedure. The development of a marketable diagnostic ESBL microarray based on the presented prototypes and the extension of the developed system towards the detection of other relevant beta-lactamase families is in progress. In conclusion, the diagnostic test developed in this study offers a promising approach for the rapid identification and epidemiologic monitoring of TEM or SHV ESBL and IRT beta-lactamases.Item Open Access The Lipase Engineering Database – a navigation and analysis tool for protein families(2003) Fischer, Markus; Pleiss, JürgenThe Lipase Engineering Database (http://www.led.uni-stuttgart.de) integrates information on sequence, structure, and function of lipases, esterases, and related proteins. Sequence data on 806 protein entries are assigned to 38 homologous families, which are grouped into 16 superfamilies with no global sequence similarity between each other. For each family, multisequence alignments are provided with functionally relevant residues annotated. Pre-calculated phylogenetic trees allow navigation inside superfamilies. Experimental structures of 45 proteins are superposed and consistently annotated. The Lipase Engineering Database has been applied to systematically analyze sequence-structure-function relationships of this vast and diverse enzyme class. It is a useful tool to identify functionally relevant residues apart from the active site residues, and to design mutants with desired substrate specificity.Item Open Access How to find soluble proteins : a comprehensive analysis of alpha/beta hydrolases for recombinant expression in E. coli(2005) Koschorreck, Markus; Fischer, Markus; Barth, Sandra; Pleiss, JürgenBackground: In screening of libraries derived by expression cloning, expression of active proteinsin E. coli can be limited by formation of inclusion bodies. In these cases it would be desirable to enrich gene libraries for coding sequences with soluble gene products in E. coli and thus to improve the efficiency of screening. Previously Wilkinson and Harrison showed that solubility can be predicted from amino acid composition (Biotechnology 1991, 9(5):443-448). We have applied this analysis to members of the alpha/beta hydrolase fold family to predict their solubility in E. coli. alpha/beta hydrolases are a highly diverse family with more than 1800 proteins which have been grouped into homologous families and superfamilies. Results: The predicted solubility in E. coli depends on hydrolase size, phylogenetic origin of the host organism, the homologous family and the superfamily, to which the hydrolase belongs. In general small hydrolases are predicted to be more soluble than large hydrolases, and eukaryotic hydrolases are predicted to be less soluble in E. coli than prokaryotic ones. However, combining phylogenetic origin and size leads to more complex conclusions. Hydrolases from prokaryotic, fungal and metazoan origin are predicted to be most soluble if they are of small, medium and large size, respectively. We observed large variations of predicted solubility between hydrolases from different homologous families and from different taxa. Conclusion: A comprehensive analysis of all alpha/beta hydrolase sequences allows more efficient screenings for new soluble alpha/beta hydrolases by the use of libraries which contain more soluble gene products. Screening of hydrolases from families whose members are hard to express as soluble proteins in E. coli should first be done in coding sequences of organisms from phylogenetic groups with the highest average of predicted solubility for proteins of this family. The tools developed here can be used to identify attractive target genes for expression using protein sequences published in databases. This analysis also directs the design of degenerate, family- specific primers to amplify new members from homologous families or superfamilies with a high probability of soluble alpha/beta hydrolases.Item Open Access Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.Item Open Access Ein GFP-basierter in-vivo-Assay für das Hochdurchsatz-Screening nach Hydrolaseaktivität(2005) Schuster, Sascha; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effektives intrazelluläres Testsystem zur Identifizierung von Hydrolaseaktivität entwickelt. Die Grundlage dieses in vivo Assays beruht auf dem Auftreten von pH-Änderungen bei Hydrolase-katalysierten Substratspaltungen. Ratiometrisches pHluorin, eine pH-sensitive Mutante von Green Fluorescent Protein (GFP) fungierte als Detektor zur Bestimmung dieser pH-Änderungen. pHluorin besitzt im Gegensatz zu GFP zwei pH-abhängige Peaks bei 395 bzw. 475 nm, deren Maxima sich innerhalb eines pH-Bereichs von 8,0 bis 5,5 reversibel zueinander verschieben. Das aus den beiden Peaks gebildete Fluoreszenzemissionsverhältnis R475/395 kann - gemessen bei einer maximalen Emission bei 508 nm - direkt als Maß für intrazelluläre pH-Änderungen herangezogen werden. Die praktische Anwendung dieses Prinzips wurde zunächst durch Koexpression von pHluorin und der Esterase aus Geobacillus stearothermophilus (BSE) als Modellhydrolase in Escherichia coli (E. coli) Zellen und anschließender Hydrolyse verschiedener Ester untersucht. So zeigten Zellen nach Expression von pHluorin und Esterase, in Abhängigkeit von der Enzymaktivität gegenüber den untersuchten Substraten eine mehr oder weniger starke Änderung des Fluoreszenzemissionsverhältnisses. Daraufhin konnte die Anwendung des Assays auch erfolgreich auf Hydantoinase- sowie Amidase-katalysierte Substrathydrolysen erweitert werden. Außerdem wurden verschiedende Experimente im Mikrotiterplattenformat sowie in der Durchflusszytometrie im Hinblick auf eine erfolgreiche Assayapplikation im Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Enzymbibliotheken durchgeführt. Zur Etablierung im Hochdurchsatz-Screening wurde mittels error-prone PCR eine Mutantentenbibliothek der Esterase I aus Pseudomonas fluorescens (PFE I) aufgebaut und mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Nachweissystems auf erhöhte hydrolytische Enzymaktivität gegenüber g-Butyrolacton (GBL) untersucht. Auf diese Weise wurde eine Mutante mit einer 5,6-fach gesteigerten Umsatzrate von GBL im Vergleich zum PFE I-Wildtyp gefunden. Somit konnte gezeigt werden, daß eine schnelle und zuverlässige Untersuchung von Biokatalysatoren bei Anwendung des pHluorin-Assays zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken möglich ist.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.Item Open Access Impact of remote mutations on metallo-beta-lactamase substrate specificity : implications for the evolution of antibiotic resistance(2005) Ölschläger, Peter; Mayo, Stephen L.; Pleiss, JürgenMetallo-beta-lactamases have raised concerns due to their ability to hydrolyze a broad spectrum of beta-lactam antibiotics. The G262S point mutation distinguishing the metallo-beta-lactamase IMP 1 from IMP 6 has no effect on the hydrolysis of the drugs cephalothin and cefotaxime, but significantly improves catalytic efficiency toward cephaloridine, ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem. This change in specificity occurs even though residue 262 is remote from the active site. We investigated the substrate specificities of five other point mutants resulting from single nucleotide substitutions at positions near residue 262: G262A, G262V, S121G, F218Y and F218I. The results suggest two types of substrates: type I (nitrocefin, cephalothin and cefotaxime), which are converted equally well by IMP-6, IMP-1, and G262A, but even more efficiently by the other mutants, and type II (ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin, and imipenem), which are hydrolyzed much less efficiently by all the mutants, with IMP-1 being the most active. G262V, S121G, F218Y, and F218I improve conversion of type I substrates, whereas G262A and IMP-1 improve conversion of type II substrates, indicating two distinct evolutionary adaptations from IMP-6. Substrate structure may explain the catalytic efficiencies observed. Type I substrates have R2 electron donors, which may stabilize the substrate intermediate in the binding pocket and lead to enhanced activity. In contrast, the absence of these stabilizing interactions with type II substrates may result in poor conversion and increased sensitivity to mutations. This observation may assist future drug design. As the G262A and F218Y mutants confer effective resistance to Escherichia coli BL21(DE3) cells (high minimal inhibitory concentrations), they are likely to evolve naturally.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.Item Open Access Rapid detection of neurotoxic insecticides in food using disposable acetylcholinesterase-biosensors and simple solvent extraction(2002) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D.; Bachmann, Till T.The extensive use of pesticides to protect agricultural crops necessitates reliable tools for the detection of residues in food and water, thus ensuring environmental protection and consumer safety. Neuroinhibitors such as organophosphates and carbamates in particular, represent a potential hazard to human health. These compounds are frequently found in food but conventional methods of analysis are limited as they are either time consuming or not sufficiently sensitive. As a result, a rapid and sensitive biosensor test based on AChE-inhibition was developed. The disposable AChE-biosensor was directly applied in solvent extracts of food samples using isooctane as extraction solvent. A complete assay could be performed in less than 2 hours. Recovery rates of 84 % were obtained in tests with spiked orange juice samples. Tests in food samples with a lower water content resulted in reduced recovery rates (44 % for peach pap baby food). Phosphorothionate insecticides could be detected after direct oxidation in food with N-bromosuccinimide and solvent extraction. The assay displayed a detection limit of 2 μg/kg paraoxon which was sufficient for the monitoring of maximum residue limits in food according to EU regulations.