03 Fakultät Chemie
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Item Open Access Proteinqualitätskontrolle im endoplasmatischen Retikulum : Identifizierung und Charakterisierung von Komponenten des Abbaus missgefalteter sekretorischer Proteine(2003) Hitt, Reiner; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)Das endoplasmatische Retikulum (ER), der Faltungsort von Proteinen des sekretorischen Systems, besitzt ein komplexes Netzwerk faltungsunterstützender und kontrollierender Proteine. Sekretorische Proteine, die ihre endgültige räumliche Konformation jedoch nicht erlangen, werden dem Ubiquitin-Proteasom-System zum Abbau zugeführt. Dieser Prozess wird im Allgemeinen mit ER-Degradation oder ER-assoziierte Degradation (ERAD) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden drei zur endoplasmatischen Proteinqualitätskontrolle gehörende Themengebiete bearbeitet: Als erstes wurde die Klonierung des bisher unbekannten DER7 Gens mit Hilfe der isolierten ERAD Mutante der7-1 durchgeführt. Danach erfolgte eine weitergehende Charakterisierung des Der1 Proteins und der Vergleich mit den Der1-Homologen Ydr411c (S. cerevisiae) und R151.6 (C. elegans). Zuletzt wurde der Einfluss einiger zytosolischer Chaperone auf den Abbau des ERAD Modellsubstrats CPY* untersucht. Die bisher nicht charakterisierte ERAD Mutante der7-1 bewirkt einen verlangsamten Abbau der ERAD Substratproteine CPY* und PrA*. Zusätzlich ist die Beweglichkeit dieser Proteine im elektrischen Feld verringert. Es konnte gezeigt werden, dass dies auf eine defekte Prozessierung der N-Glykoside im endoplasmatischen Retikulum zurückzuführen ist. Durch Kreuzen des der7-1 Allels mit Nullmutanten von Glukosidase I und II, durch Komplementation mit plasmidkodierter Glukosidase I und durch meiotische Kartierung wurde gefunden, dass DER7 mit CWH41 identisch ist. CWH41 kodiert für das Enzym Glukosidase I, welches bei der Prozessierung der Oligosaccharide im endoplasmatischen Retikulum einen terminalen alpha1,2-Glukoserest entfernt. Korrekt getrimmte Oligosaccharide scheinen daher für eine effiziente Proteindegradation notwendig zu sein. Das bestätigt sich durch den, für Doppelmutanten des ERAD und der „unfolded protein response“ (UPR) typischen, temperaturabhängigen Wachstumsdefekt von der7-1 deltaire1 Mutanten. Das Protein Der1 wurde schon in früheren Arbeiten als eine Komponente der ERAD-Maschinerie identifiziert. Bisher wurde jedoch eine Beteiligung nur am Abbau einiger löslicher missgefalteter Proteine nachgewiesen. Durch den Vergleich des Der1 abhängigen Abbaus von löslicher CPY* und membranständigem CTG* (CPY*-Transmembrandomäne-GFP) konnte nun gezeigt werden, dass die Funktion von Der1 unabhängig von der Missfaltung ist und sich wahrscheinlich auf die Degradation löslicher Proteine beschränkt. Eine topologische Charakterisierung von Der1 zeigte, dass der N- und der C-Terminus im Zytosol lokalisiert sind und Der1 insgesamt vier Transmembrandomänen besitzt. Es wurde außerdem gefunden, dass Der1 sehr empfindlich auf Veränderungen am Protein reagiert. Einzig kleinere Modifikationen des C-Terminus, wie das Einfügen eines einzelnen HA-Epitops oder einer N-Glykosylierungs-Konsensussequenz, erhalten die Funktionalität des Proteins. Um potentielle Interaktionspartner von Der1 zu finden, wurde nach High-Copy-Suppressoren der Temperatursensitivität von der1-2 deltaire1 Doppelmutanten gesucht. Es wurden 19 Genbankplasmide erhalten, die im Genbankinsert weder DER1 noch IRE1 enthielten. Ihre Wirkungsweise ist jedoch möglicherweise indirekt, da der Abbau von CPY* durch ihre Expression in der1-2 Mutanten nicht wiederhergestellt wurde. Die fortschreitende Genomsequenzierung ermöglichte inzwischen die Identifizierung einer „Der1-ähnlichen“ Familie mit mehr als 15 Vertretern aus den unterschiedlichsten Organismen. Zwei dieser homologen Proteine sind Ydr411c aus S. cerevisiae und R151.6 aus C. elegans. Das Der1 homologe Protein Ydr411c wurde wegen seiner Zugehörigkeit zur „Der1-ähnlichen“ Familie Dfm1 (Der1-like family member) benannt. Ebenso wie Der1, besitzt Dfm1 einen zytosolischen C-Terminus und ist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Im Gegensatz zur deltader1 deltaire1 Doppelmutation, führt die deltadfm1 deltaire1 Doppeldeletion jedoch nicht zu temperatursensitiven Hefestämmen. Des Weiteren konnte nur ein äußerst schwacher Einfluss von Dfm1 auf den Abbau des ERAD Substrats CPY* festgestellt werden. Das C. elegans Protein R151.6 hingegen, scheint dieselbe Funktion wie Der1 der Hefe auszuüben. Seine heterologe Expression in deltader1 deltaire1 Doppelmutanten hob die konditionale Letalität dieses Stamms auf. Das deutet darauf hin, dass die Funktion von Der1 auch in höheren Organismen konserviert ist. Als weiteres stellte sich die Frage ob die zytosolischen Chaperone der Hsp90 und Hsp100/Clp am Abbau löslicher ERAD Substrate beteiligt sind. Die in dieser Arbeit getesteten deltahsc82, deltahsp82, deltasti1, deltasba1 und deltahsp104 Nullmutanten zeigten jedoch keinen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit von CPY*. Ob zytosolische Chaperone generell nur beim Abbau von Membransubstraten eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.Item Open Access Einfluss der Herstellungsparameter auf die mechanischen Eigenschaften von Si-(B-)C-N-Precursorkeramiken(2002) Bauer, Arndt; Aldinger, Fritz (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit ist es, den Herstellungsprozess für Precursorkeramiken zu optimieren und den Einfluss einzelner Herstellungsparameter auf die Eigenschaften und insbesondere auf die Hochtemperaturkriechverformung von Si-(B)-C-N-Precursorkeramiken zu charakterisieren. Am Beispiel eines kommerziell erhältlichen Polysilazans Ceraset werden als wichtigste Parameter die Vernetzungstemperatur der Polymere, die Polymerpartikelgröße nach dem Mahlen und Sieben sowie die Press- und Pyrolysebedingungen betrachtet. Dabei zeigt sich, dass die geringste Porosität einer Keramik, die über das Pressen von Polymerpulver erhalten werden kann, bei etwa 11 % liegt. Es stellt sich heraus, dass vor allem die Porosität des gepressten Grünlings für die Enddichte der Keramik ausschlaggebend ist und im optimalen Fall etwa 7 % beträgt. Von spezieller Bedeutung ist dabei die offene Porosität. Die nach außen offene Porenkanäle werden benötigt, um während der Pyrolyse ein Entweichen der Gase aus dem Grünling zu ermöglichen. Die Porosität des Grünlings hängt von der Viskosität des Polymers während des Pressvorgangs ab und kann deshalb über die Parameter Vernetzungsgrad und Warmpresstemperatur gesteuert werden. Zusätzlich zur Dichte und Hochtemperaturstabilität werden weitere Eigenschaften wie die Hochtemperaturverformung, die Bruchzähigkeit, der Elastizitätsmodul und die Biegefestigkeit von Precursorkeramiken in Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen ermittelt. Eine simultane Maximierung aller untersuchten Eigenschaften ist nicht möglich, so dass für bestimmte Anforderungsprofile Kompromisse gesucht werden müssen. Als Parameter mit der größten Wirkung auf die Eigenschaften hat sich die Partikelgröße erwiesen. Große Partikel haben einen positiven Einfluss auf die Bruchzähigkeit und die Hochtemperaturstabilität, wohingegen kleine Partikel sich vorteilhaft auf die Hochtemperaturkriechverformung und die Biegefestigkeit auswirken. Die Hochtemperaturverformung wurde durch Experimente bei konstanten Spannungen und Temperaturen zwischen 1350 und 1500 °C untersucht. Es wurde eine detaillierte Charakterisierung der Zeit-, Spannungs- und Temperaturabhängigkeit sowohl unter Druck- (bis 300 MPa) als auch unter Biegebeanspruchung (bis 50 MPa) durchgeführt. Dabei wird bei beiden Beanspruchungsarten selbst bei einer Versuchsdauer von bis zu zwei Wochen kein stationäres Kriechen beobachtet. Die Dehnraten sinken vielmehr auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze ab. Es wird versucht, das Freie-Volumen-Modell, das ursprünglich zur Beschreibung der Relaxation in metallischen Gläsern entwickelt und inzwischen vor kurzem erfolgreich auf Precursorkeramiken übertragen wurde, auch bezüglich der Gültigkeit für die hier untersuchten Materialien zu überprüfen.Item Open Access Untersuchungen fluider Systeme mit Computersimulationen und Neutronenbeugungsexperimenten(2004) Kreitmeir, Markus; Bertagnolli, Helmut (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das Zusammenspiel von Neutronenbeugungsexperimenten und Computersimulationen sich als äußerst produktiv hinsichtlich der Untersuchung der Struktur von Fluiden erweist. Durch die durchgeführten Hochdruckneutronenbeugungsexperimente wurden Strukturinformationen für einen großen Bereich thermodynamischer Zustände zugänglich. Die experimentellen Daten sind mit Hilfe von Computersimulationen genauer analysiert worden. Zu früheren Hochdruckmessungen an flüssigem und überkritischem Fluorwasserstoff wurden ab initio Molekulardynamik Simulationen nach der Methode von Car und Parrinello durchgeführt. Diese beschreiben die Änderung der Struktur des Systems sehr gut. Wegen des großen rechnerischen Aufwands wurden diese Simulationen am HLRS, dem Stuttgarter Höchstleistungsrechenzentrum, durchgeführt. Es wurden außerdem die vom Fluorwasserstoff gebildeten Assoziate analysiert. Es ließ sich zeigen, daß die Größe der Assoziate mit zunehmender Temperatur und abnehmender Dichte abnimmt. Aus den ab initio Simulationen konnten darüber hinaus die Änderung der Bindungslänge sowie des Dipolmoments des Fluorwasserstoffmoleküls mit Temperatur und Dichte hervorragend beschrieben werden. Weiterhin konnten dynamische Größen bestimmt werden. Die gewonnenen Daten sind in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Werten, soweit diese existieren. Für diese Zustände von Fluorwasserstoff wurden auch force field Simulationen mit zwei bekannten Paarpotentialen gemacht. Außerdem wurde in dieser Arbeit ein neues Potential vorgestellt, das die Struktur des Fluorwasserstoffs am besten beschreibt. Nur bei einem literaturbekannten Paarpotential waren Aussagen über Bindungslänge und Dipolmoment möglich, die Resultate waren aber – im Gegensatz zu den Car-Parrinello Simulationen – nicht befriedigend. Bei Aufenthalten am Forschungsreaktor am Institut Laue-Langevin in Grenoble (F) und der Spallationsquelle ISIS nahe Oxford (GB) wurden Neutronenbeugungsexperimente an Fluorwasserstoff in der Gasphase sowie an überkritischem Methan durchgeführt. Die experimentellen Daten gasförmigen Fluorwasserstoffs weisen eine starke Abhängigkeit der Nahordnung mit der Dichte des Systems auf. Zu diesen Zuständen wurden wiederum force field Simulationen durchgeführt. Die experimentellen Daten konnten unter anderem mit Hilfe des neu entwickelten Potentials erklärt werden. Es konnte gezeigt werden, daß auch die Gasphase aus kurzen Fluorwasserstoffketten besteht; es existieren aber auch oligomere Ringe. Die Neutronenbeugungsexperimente an Deuteromethan und Methan vervollständigen eine Reihe von Experimenten, mit der die Nahordnung des Systems eingehender untersucht werden sollte. Weiterhin wurden bereits ermittelte Streudaten einer CD4/CH4 Mischung ausgewertet. Die Daten des reinen Methans erwiesen sich wegen der hohen inkohärenten Streuung des Wasserstoffs als nicht verwertbar. Genauere Strukturinformationen des Systems konnten mit Hilfe von EPSR Simulationen erhalten werden. Diese auf der Monte-Carlo Methode basierenden Simulationen führen eine Verbesserung gegebener Paarpotentiale mit Hilfe experimenteller Streudaten durch. Es konnte gezeigt werden, daß Systeme mit einfachen intermolekularen Wechselwirkungen durch Paarpotentiale ausreichend gut beschrieben werden können. Bei komplexeren intermolekularen Wechselwirkungen versagen diese aber im allgemeinen. Die Struktur fluiden Fluorwasserstoffs wird durch ab initio Simulationen deutlich besser wiedergegeben, als es Paarpotentiale vermögen. Außerdem besitzen die Car-Parrinello Simulationen die Fähigkeit, umfassende Aussagen über die Struktur und die Dynamik von Systemen zu machen. Aufgrund von Beschränkungen, die klassischen Modellen auferlegt werden – wie z.B. ein fester Bindungsabstand -, ist dies bei force field Simulationen nicht unbedingt möglich.Item Open Access Die alpha-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens: Verbesserung der Alkaliaktivität und Steigerung der spezifischen Aktivität mittels gerichteter Evolution(2002) Bessler, Cornelius; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Amylasen werden häufig in Waschmitteln eingesetzt. Diese Anwendung werden Amylasen benötigt, die eine hohen Stabilität und Aktivität bei alkalischem pH besitzen. Zudem ist eine hohe spezifische Aktivität wünschenswert, da so Enzymmenge und dadurch Kosten gespart werden können. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung von Methoden der gerichteten Evolution auf die Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens (BAA) zur Steigerung der spezifischen Aktivität und der Alkaliaktivität. Die Gene für die BAA sowie zwei Punktmutanten derselben wurden durch Error-prone PCR mutagenisiert und durch Gen-Shuffling rekombiniert. Zur Durchmusterung der Mutantenbibliotheken wurde ein Hochdurchsatz-Test auf Basis des kommerziell erhältlichen Phadebas(r)-Tests entwickelt. Das pH-Optimum von Mutante 42 ist um eine pH-Einheit zu höheren pH-Werten verschoben und liegt bei pH 7. Dies führt zusammen mit einer um den Faktor fünf höheren Aktivität bei pH 10 zu einem verbreiterten pH-Profil. Außerdem stieg die Aktivität in den Periplasmafraktionen um den Faktor vier und die spezifische Aktivität um den Faktor 1,5 als beim Wildtyp. Eine weitere Mutante, Mutante 29 zeigt das pH-Profil des Wildtyps. Allerdings liegen Aktivität der Periplasmafraktionen und spezifische Aktivität um den Faktor 40 beziehungsweise um den Faktor 9 höher als beim Wildtyp. Mutante B1, die durch Error-prone PCR mit der Mutante 29 erzeugt wurde zeigt ebenfalls das pH-Profil des Wildtyps. Zudem ist ihre spezifische Aktivität niedriger als die der Mutante 29, aber immerhin noch um den Faktor 4,2 höher als die des Wildtyps. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Mutanten mit dem Wildtyp und mit homologen Amylasen konnte der Einfluss der einzelnen Mutationen erklärt werden.Item Open Access High rate electrochemical dissolution of iron-based alloys in NaCl and NaNO3 electrolytes(2002) Wagner, Thomas; Mittemeijer, Eric Jan (Prof. Dr. Ir.)With the investigations presented in this work, the reaction mechanisms and principles of steels upon the high rate electrochemical dissolution in activating NaCl electrolytes and passivating NaNO3 electrolytes are revealed and the role of anodic surface films developing at the substrate surface is included in schematic dissolution models. For the development of accurate dissolution models, mask-less Electrochemical Machining (ECM) experiments with the flow channel cell at high electrolyte flow rates (up to 7 m/s) and current densities up to 70 A/cm2 were carried out in combination with following ex situ surface analysis. On the basis of these experiments a satisfactory dissolution model for heterogeneous steel substrates is presented, with special respect to the influence of local turbulences in the flowing electrolyte. To specify and characterize the electrochemical behaviour of the examined electrolyte / substrate combination, polarization measurements with the rotating cylinder electrode(RCE) are presented.Item Open Access Reporterassays und Oligonukleotid-Mikroarrays zur Überwachung der Bildung von Wasserblüten und zur frühen Erkennung ihrer potentiellen Toxizität(2002) Schreiter, Pat; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Seit einigen Jahrzehnten werden immer häufiger Wasserblüten in Gewässern beobachtet. Die Ursache dafür ist die abnormale Massenvermehrung von Cyanobakterien. Der genaue Grund für diese Erscheinung ist noch nicht bis ins Detail geklärt. Es wurde jedoch beobachtet, daß bestimmte Muster der Nährstoffverfügbarkeit, im wesentlichen Phosphor, die cyanobakterielle Proliferation fördern. Wegen des Geruchs und Gestanks werden die Wasserqualität und die Trinkwasserversorgung durch Wasserblüten erheblich beeinträchtigt. Außerdem produzieren viele wasserblütenbildende Cyanobakterien Toxine, so daß der Verzehr vom wasserblütenhaltigen Wasser gesundheitsschädlich sein kann. Um die mit Wasserblüten einhergehenden Probleme zu vermeiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Assays als ein Frühwarnsystem zur Überwachung von Wasserblüten- sowie Cyanotoxinbildung entwickelt. Ausgehend von einem cyanobakteriellen Reporterstamm mit der Konstruktion PphoA::luxAB im Genom wurde ein lumineszierender Reporterassay zur Detektion der für Cyanobakterien verfügbaren Phosphatquellen entwickelt. Durch Immobilisierung ist der Sensor lagerfähig und der Assay leicht handhabbar. Basierend auf der Hybridisierungstechnik konnte in dieser Arbeit mit spezifischen Sonden ein Assay im Mikroarray-Format zur molekulargenetischen Detektion von der in Wasserblüten am häufigsten gefundenen cyanobakteriellen Gattung Microcystis und dem Gen der für die Produktion von hepatotoxischen Microcystinen verantwortlichen Microcystin-Synthetase entwickelt werden. Dieser Oligonukleotid-Mikroarray ermöglicht eine schnelle Identifizierung der in Wasserblüten beteiligten Microcystis-Stämme und eine einfache Beurteilung der Gefährdung durch "blühende" Gewässer.Item Open Access Untersuchungen zur inneren Struktur von Hydrogelen aus N-Isopropylacrylamid mittels statischer Lichtstreuung(2005) Brunner, Birgit M.; Oppermann, Wilhelm (Prof. Dr.)Hydrogele mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur sind in den vergangenen Jahren als intelligente Werkstoffe verstärkt ins Zentrum des Interesses gerückt. Für die Eigenschaften eines Gels ist dessen innerer Aufbau entscheidend, aber aus theoretischer Sicht bisher wenig verstanden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung solcher temperatursensitiver neutraler Hydrogele mittels statischer Lichtstreuung mit dem Ziel, die Eignung unterschiedlicher Ansätze zur quantitativen Beschreibung der inhomogenen inneren Struktur von Polymernetzwerken kritisch zu prüfen. Die sogenannten klassischen empirischen Ansätze nach P. Debye und A.M. Bueche, A. Guinier oder L.S. Ornstein und F. Zernike basieren alle auf der prinzipiellen Annahme, daß sich die Streuintensität eines Gels R(Gel) additiv aus zwei voneinander unabhängigen Beiträgen zusammensetzt: R(Gel) = R(Lsg.) + R(E). Der rein dynamische Anteil soll dabei durch die Streuintensität einer mäßig konzentrierten Lösung eines zum betrachteten Gel analogen unvernetzten Polymers R(Lsg.) ersetzt werden können. Die Exzeß-Streuung R(E) wird dem ausschließlich statischen Anteil zugeschrieben und kann experimentell durch Differenzbildung der gemessenen Streuintensitäten von Gel und Lösung ermittelt werden. S. Panyukov und Y. Rabin stellten 1996 einen mathematisch aufwendigeren phänomenologischen Ansatz vor, der auf den Ergebnissen einer exakten statistisch-mechanischen Analyse basiert. Die Grundgleichung zur Berechnung des die innere Netzwerkstruktur eines statistisch vernetzten neutralen Gels beschreibenden Strukturfaktors S ist formal genauso aufgebaut wie die klassischen Ansätze: S = G + C (G: thermisch-dynamischer Korrelator, C: statischer Korrelator). Diese Größen können in Streuintensitäten R umgerechnet und so mit experimentell bestimmten Daten verglichen werden. Im Rahmen der PR-Theorie können zudem verschiedene Lösungsmittelbedingungen berücksichtigt werden. Diese ändern sich für die betrachteten Systeme mit der Temperatur. Die untersuchten Hydrogele wurden durch redox-initiierte radikalisch vernetzende Copolymerisation des Monomers N-Isopropylacrylamid mit N,N´-Methylenbisacrylamid als Vernetzer hergestellt. Die Synthese der wäßrigen Lösungen des unvernetzten Polymers erfolgte analog, nur ohne Vernetzer, die Charakterisierung mittels 1H und 13C-NMR-Spektroskopie. Insgesamt wurden drei verschiedene Gel-Lösungs-Systeme im Herstellungszustand betrachtet. Die mechanischen Eigenschaften der Gele wurden durch statische Schubmodulmessungen bestimmt. Die Exzeß-Streuung weist im Widerspruch zu den Vorhersagen der klassischen Ansätze für alle drei Gel-Lösungs-Systeme eine deutliche Temperaturabhängigkeit auf (in Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen). Zudem werden bei der graphischen Auftragung nach den klassischen Auswerteverfahren teilweise nicht die erwarteten Geraden erhalten. Die ermittelten zwei charakteristischen Strukturparameter, die Korrelationslänge und das mittlere Schwankungsquadrat des Brechungsindex, zeigen jedoch bei allen drei Systemen gleiche Tendenzen mit ansteigender Meßtemperatur, wie auch die mittels einer anlogen Auswertung bestimmten Parameter der Polymerlösungen. Die nach der PR-Theorie durchgeführten Berechnungen ergeben bei allen betrachteten Lösungsmittelbedingungen für die Streuintensität fast immer erheblich zu kleine Werte. Die genauen Gründe für diese Abweichungen sind schwer zu fassen. Viel wichtiger ist allerdings die Beobachtung, daß das Streuverhalten bei Erhöhung der Temperatur von den Korrelatoren nicht adäquat wiedergegeben wird. Die Erweiterung anderer Autoren, die neben den beiden extremen Lösungsmittelbedingungen (gut und theta) durch Einführung des Flory-Hugginsschen Wechselwirkungsparameters zusätzlich noch mittlere Lösungsmittelqualitäten berücksichtigen, scheint sehr sinnvoll zu sein. Damit wird die Temperaturabhängigkeit der Streuintensität etwas besser beschrieben. Die durchgeführten Untersuchungen zum Streuverhalten temperatursensitiver Hydrogele deuten darauf hin, daß bei der Exzeß-Streuung wohl noch dynamische Anteile enthalten sind oder eine Kopplung zwischen statischem und dynamischem Teil vorliegt. Gerade im Hinblick auf die Temperaturabhängigkeit der Streuintensität werden sowohl die klassischen empirischen Ansätze als auch die Theorie von S. Panyukov und Y. Rabin den komplexen gegenseitigen Abhängigkeiten innerhalb der Struktur solcher Gele nicht gerecht. Bei der Herleitung der angegebenen Gleichungen werden zu viele zu stark vereinfachende Annahmen gemacht und der Einfluß der Herstellungsbedingungen auf den Aufbau der inneren Struktur (z.B. Netzwerkfehler) wird deutlich unterschätzt. Auch das Verhalten der analogen Polymerlösungen im mäßig konzentrierten Bereich könnte komplizierter sein als gedacht. Der prinzipielle Ansatz in Form einer einfachen Addition zweier voneinander unabhängiger Beiträge muß aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit auf jeden Fall in Frage gestellt werden.Item Open Access Isolierung des humanen Lactasegens und seine Expression in der Hefe Pichia pastoris(2002) Bethge, Rut; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lactase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) katalysiert bei der Verdauung die hydrolytische Spaltung des Milchzuckers Lactose in Glucose und Galactose. Dieses Enzym ist im Bürstensaum des Dünndarms der Säugetiere lokalisiert. Seine Aktivität wird nach dem Ende der Laktationsphase sehr stark gesenkt, bzw. die Synthese in Teilabschnitten des Darms eingestellt, was eine Lactoseintoleranz bei 75 % der Weltbevölkerung zur Folge hat. Eine Ausnahme stellen hierbei Nordeuropäer und einige afrikanische Völker mit traditionellem Konsum von Milch und Milchprodukten dar. Mit dem Lactosemetabolismus sind unter anderem die Stoffwechselkrankheiten Milchunverträglichkeit, die durch einen Defekt in der Lactase-Synthese zustandekommt, und Galactosämie, die auf dem genetischen Defekt der Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase (GALT) beruht, verbunden. Während die Symptome, Durchfall und Erbrechen, der Milchunverträglichkeit weniger schwerwiegend sind, führt der Verlauf von Galactosämie unbehandelt zu geistiger Zurückgebliebenheit und in vielen Fällen zum Tod. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Entwicklung denkbarer Behandlungsstrategien der Galaktosämie durchgeführt. Der Grundgedanke ist, die negativen Folgewirkungen der Galactosämie durch Hemmung des ersten Enzyms des Lactosemetabolismus, der LPH, unter Akzeptanz der Folgen einer Milchunverträglichkeit, zu unterbinden. Hierbei kamen unterschiedliche Glycosidaseinhibitoren zum Einsatz. Erstens wurde die humane Lactase-Phlorizin-Hydrolase in Pichia pastoris exprimiert und die Quantifizierbarkeit ihrer Lactaseaktivität in dem Test auf Disaccharidase-Aktivität nach Dahlqvist untersucht. Zweitens wurde die Anwendbarkeit des Testsystems zur Charakterisierung einer LPH-Hemmung im Allgemeinen, bzw. zur Suche nach neuen spezifischen LPH-Inhibitoren untersucht. Die LPH wurde aus menschlichen Dünndarmgewebeproben isoliert. Dazu wurde ihre Gesamt-RNA isoliert, die mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA übersetzt wurde. Daraus konnten durch PCR sowohl die Lactase-, als auch die Phlorizin-Hydrolase-Domäne der LPH amplifiziert werden. Durch den Vergleich ihrer DNA-Sequenzen mit der 1988 von Mantei et al. veröffentlichten Sequenz der LPH ergaben sich in beiden Domänen jeweils 6 Basenabweichungen, von denen angenommen wurde, dass es sich dabei um Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) handelt. Die Gesamt-LPH wurde durch Zusammenfügen der beiden Einzeldomänen mittels "Overlap-Extension" erhalten. Bei der Sequenzierung der Gesamt-LPH ergaben sich vor allem im hinteren Bereich, am 3'-Ende, Basenabweichungen, die in den ursprünglichen Einzeldomänen nicht vorhanden waren. Es muß demnach davon ausgegangen werden, daß es sich bei diesen Variationen nicht um SNPs sondern um Mutationen handelt. Sowohl die einzelnen Domänen, als auch die Gesamt-LPH wurden in dem eukaryotischen System der Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe des Testes auf Disaccharidaseaktivität nach Dahlqvist auf ihre Lactose-Hydrolyse-Aktivität untersucht. Das Verfahren wurde dabei auf eine Anwendung im Mikromaßstab modifiziert. Während die exprimierte Phlorizin-Hydrolase-Domäne alleine nur geringe Lactaseaktivität zeigte, konnte nach Expression der Lactase-Domäne, sowie der Gesamt-LPH deren hydrolytische Aktivität nachgewiesen werden. Die Lactaseaktivität konnte somit der Lactase-Domäne zugeordnet werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der in der Literatur veröffentlichten Sequenz aktiv. Die Expression in Pichia pastoris ermöglicht es demnach, die Aktivität von Varianten der LPH auf einfache Art und Weise zu testen. Zur Durchführung weiterer Experimente sollte ein mutationsfreies Gen hergestellt werden, um einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, und festzustellen, wie viele Polymorphismen das Gen besitzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modifizierte Dahlqvist-Test eingesetzt, um Verbindungen auf ihre hemmende Wirkung auf die Lactase-Phlorizin-Hydrolase, bzw. ihre Einzeldomänen, zu prüfen. Mit Phlorizin, einem Lactasehemmer, konnte die Zuverlässigkeit des Tests bestätigt werden. Die rekombinanten Proteine waren trotz ihrer Abweichungen von der Literatur für Inhibitionsversuche geeignet. Das Testsystem erlaubt somit die gezielte Durchmusterung synthetisch hergestellter Verbindungen auf deren inhibitorische Wirkung gegenüber der Lactaseaktivität und die Untersuchung der Wirkungsweise von Inhibitoren auf verschiedene Varianten der LPH. Auch für einen von dem Institut für Organische Chemie der Universität Stuttgart synthetisch hergestellten ß-Glucosidase- und ß-Galactosidase-Inhibitor konnte eine Hemmung der Lactaseaktivität festgestellt werden. Eine weitere, gezielte Durchmusterung von Verbindungen mit Hilfe des etablierten Systems könnte somit zur Charakterisierung neuer Inhibitoren führen und alternative Ansätze zur therapeutischen Behandlung von Galaktosämie eröffnen.Item Open Access Synthese und Kristallstrukturbestimmung von Oxoboraten und Chlorid-Oxoboraten dreiwertiger Selten-Erd-Elemente(2004) Nikelski, Tanja; Schleid, Thomas (Prof. Dr.)Untersuchungen an Phasendiagrammen in den Systemen M2O3 – B2O3 (M = Sc, Y, La; Ce – Lu) zeigen die Existenz von drei verschiedenen Formeltypen, ortho-Oxoborate MBO3, meta-Oxoborate M(BO2)3 und Oxid-Oxoborate M3BO6 (≡ M3O3[BO3]), die bisher jedoch noch nicht anhand von Einkristalldaten charakterisiert werden konnten. Der Bereich der ortho-Oxoborate MBO3 mit sieben verschiedenen Strukturtypen in Abhängigkeit vom Ionenradius des Selten-Erd-Kations (M3+) und den Darstellungsbedingungen ist gut erforscht. Bei den meta-Oxoboraten M(BO2)3 existieren bisher Einkristallstrukturdaten für die Lanthanide M = La – Gd, bei den Elementen Tb – Lu war die Struktur noch ungeklärt. In dieser Arbeit ist es gelungen, die Kristallstruktur von M(BO2)3 (M = Tb, Dy) anhand von Einkristalldaten zu bestimmen. Dieser orthorhombische Strukturtyp wird aus stark gewellten Schichten aufgebaut. Die B3+-Kationen werden, im Gegensatz zu jenen des bisher bekannten monoklinen Strukturtyps, allesamt tetraedrisch von Sauerstoff umgeben. Auch die Synthese eines ultra-Oxoborates der Zusammensetzung La4B14O27 (orthorhombisch) ist gelungen. Diese Verbindung basiert auf einem Raumgitter, bestehend aus trigonal und tetraedrisch von Sauerstoff umgebenen Borkationen. Im System M2O3 – MCl3 – B2O3 waren bisher zwei Formeltypen bekannt: MCl(BO2)2 (M = La, Pr; triklin), formal ein meta-Oxoborat, in dem eine Oxoborat-Einheit durch ein Cl–-Anion ersetzt wird, und Er2Cl2[B2O5] (orthorhombisch), mit planaren Oxodiborat-Einheiten. Es lag nahe, die Reihe für die Zusammensetzung MCl(BO2)2 mit Ce3+ zu komplettieren. Dabei konnte ein weiterer Formel- und Strukturtyp, M3Cl3[BO3] (M = La, Ce; hexagonal), dargestellt werden. Welche der beiden Verbindungen nun kristallisiert, ist vom stöchiometrischen Verhältnis der eingesetzten Edukte und der Temperatur abhängig. Verbindungen der Zusammensetzung MCl(BO2)2 und M3Cl3[BO3] sind aufgrund der hohen Koordinationszahlen (CN = 10) am M3+-Kation nur für die leichteren, aber größeren Selten-Erd-Kationen (M = La – Nd) zu erwarten. Deshalb ist es interessant, welche Strukturen bei den kleineren, schwereren Selten-Erd-Kationen realisiert werden können. Der Formeltyp M2Cl2[B2O5] war bisher nur mit M = Er darstellbar, nun konnte er auch mit M = Sc realisiert werden. Die Koordinationszahlen am M3+-Kation von sechs und sieben lassen vermuten, daß diese Struktur auch mit den Elementen M = Y; Sm – Lu zugänglich ist. In den bisher genannten Verbindungen kann man, ausgehend vom meta-Oxoborat, formal Borateinheiten durch Cl–-Anionen ersetzen. Dies bedeutet, daß die MCl(BO2)2-Struktur Ketten der Zusammensetzung {[BO2]–} aus eckenverknüpften, trigonal planaren Oxoborat-Einheiten als charakteristische Baueinheit aufweist, da hier nur eine Oxoborat-Einheit ersetzt wurde. In M2Cl2[B2O5] wurden zwei Oxoborat-Einheit durch Cl–-Anionen substituiert, deshalb liegen hier diskrete Oxodiborat-Einheiten [B2O5]4– vor und der formale Austausch einer weiteren Oxoborat-Einheit in M3Cl3[BO3] führt zu isolierten, trigonal planaren Oxoborat-Einheiten [BO3]3– als strukturellem Charakteristikum. Analog zu den noch schlecht charakterisierten Oxid-Oxoboraten wurden erstmals Oxidchlorid-Oxoborate der dreiwertigen Selten-Erd-Elemente synthetisiert. Die Strukturen des Formeltyps M4O4Cl[BO3] (M = Dy – Tm) sind monoklin und weisen eine stark gewellte Schichtstruktur, bestehend aus sauerstoffzentrierten, ecken- und kantenverknüpften Tetraedern [OM4]10+ einerseits sowie diskreten Oxoborat-Einheiten [BO3]3– und Chlorid-Anionen Cl– andererseits auf. Mit Koordinationszahlen von sieben und acht am M3+-Kation ist diese Verbindungsklasse ebenfalls bei den schwereren, kleineren Selten-Erd-Elementen (M = Sc, Y; Eu – Tb, Lu) zu erwarten. Von Interesse wäre es, die dargestellten Verbindungen auf Eigenschaften als „host materials“ für Leuchtstoffe zu untersuchen. Es ist zu erwarten, daß sie einfach und auch mehrfach dotiert interessante Lumineszenzeigenschaften aufweisen, da Boratpräparate hierfür bekannt sind.Item Open Access Screening, nucleotide sequencing and biochemical characterisation of novel lipolytic enzymes from Bacillus sp. 01-855 associated with marine sponge Aplysina aerophoba(2004) Karpushova, Anna Alexandrovna; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)The particular microbial ecology of the sponge mesohyl with respect to the high number of taxonomically diverse bacteria provides vast potential for biotechnology in terms of novel enzymes and bioactive compounds. The uncharacterised micro-organisms can be novel sources for the enzymes and biologically active compounds with little overlap to those of terrestrial origin. In this work identification and preliminary physiological characterisation of a novel Bacillus sp. 01-855 isolated from the marine sponge Aplysina aerophoba was performed. Two novel esterases (EC 3.1.1.1) called EstB1 and EstB2 and a new putative amidase (EC 3.5.1.) AmdB1 were isolated from genomic DNA library of Bacillus sp. 01-855 by means of screening using plate assay. The estB1, estB2 and amdB1 were cloned and functionally expressed in E. coli. The purification of the EstB1 and EstB2 to homogeneity was done in a single step by IMAC. Refolding method for the EstB2 esterase, which forms inclusion bodies, was established. Preliminary biochemical characterisation of the EstB1 and EstB2 esterases was done. The biochemical characterisation revealed the unique properties of the EstB1 and EstB2 esterases, that could be potentially used for different biotechnological applications. Further studies on the biochemical properties of the AmdB1 amidase are necessary.