Universität Stuttgart
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Item Open Access Entwicklung analytisch-molekularbiologischer Verfahren zur Konstruktion einer Plasmid-Genbank aus Boden-DNA in Escherichia coli und deren Durchmusterung nach neuen Enzymen für die technische Anwendung(2004) Zipper, Hubert; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)Das große Artenreichtum mikrobieller Organismen in der Natur hat im Verlauf der Evolution zu einer Vielzahl unterschiedlicher Enzyme geführt. Da weniger als ein Prozent der Bodenmikroorganismen mit gängigen Methoden kultivierbar ist, wird in neueren Verfahren versucht, die genomische DNA aus Bodenproben zu isolieren, in einen Expressionswirt zu klonieren und die Genbank nach neuen Enzymen für die technische Anwendung zu durchmustern. Diese Vorgehensweise ist aber mit einer Reihe von technologischen Problemen verbunden. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung, Isolierung und Reinigung von Boden-DNA sowie die Erstellung einer Genbank, um diese nach Hydrolasen und Oxidoreduktasen zu untersuchen. Zunächst galt das Interesse der Entwicklung einer Methode zur DNA-Quantifizierung in Boden-Extrakten mittels SYBR-Green-I-(SG)-Fluoreszenz, die durch co-extrahierte Huminsäuren gestört wird. Die Aufklärung der Struktur von SG bildete die Basis für Interaktionsstudien zwischen dem Farbstoff, DNA und Huminsäuren. Es zeigte sich, dass SG in Abhängigkeit vom Farbstoff/Basenpaar-(Fbp)-Verhältnis einen biphasischen Bindungsmodus an DNA aufweist. Einerseits konnte mit hydrodynamischen Messungen (Semi-)Interkalation nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite deuteten Untersuchungen mit den Homopolymeren Poly(dA)Poly(dT) und Poly(dG)Poly(dC) darauf hin, dass SG sich bei hohen Fbp-Verhältnissen in die kleine Furche der DNA einlagert. Ausgehend von diesen Ergebnissen konnte die durch Huminsäuren verursachte Fluoreszenz-Löschung auf Störmechanismen wie den inneren Filtereffekt, dynamische Fluoreszenz-Löschung und kompetitive Bindung von SG zurückgeführt werden. Darauf aufbauend wurde ein neuer Test entwickelt und umfassend validiert. Ein weiterer Teil der Arbeit bestand darin, Techniken zur Gewinnung, Reinigung und enzymatischen Spaltung von Boden-DNA zu untersuchen. Die DNA-Extraktion aus Bodenproben erfolgte in Anlehnung an ein in der Literatur beschriebenes Verfahren. Die durch Huminstoffe kontaminierten DNA-Extrakte konnten mit Hilfe von Ausschlusschromatographie-Säulen gereinigt werden. Die nachfolgende DNA-Spaltung war mit dem Enzym EcoRI möglich, wobei der Einfluss nicht-abgetrennter Huminstoffe durch Zugabe von Rinderserumalbumin minimiert wurde. Anschließend folgte die Ligation der DNA in den Vektor pJOE930. Nach Transformation in E. coli wurden etwa 43000 Transformanden auf Tributyrin-Platten ausplattiert, wobei 19 Klone eine lipolytische Aktivität zeigten. Die Untersuchung des Substratspektrums ergab einen Klon (Klon HZ04) mit interessanten Eigenschaften bei der Hydrolyse verschiedener para-Nitrophenyl-(pNP)-Ester, wie z.B. pNP-Butyrat, -Caproat, -Caprylat, -Laurat, -Palmitat, -Acrylat, und -Methacrylat sowie in geringem Umfang pNP-Trimethylacetat. Das abgeleitete Protein zeichnet sich durch ein GDSAG- und ein GGGx-Motiv aus. Letzteres ist charakteristisch für die sog. Oxyanionbindungstasche von Hydrolasen. Zirka 13000 der Transformanden wurden mit weiteren Testsystemen untersucht. Auf stärkehaltigen Agarmedien konnten 16 Amylase-aktive Klone identifiziert werden. Keiner der Klone zeigte eine proteolytische Aktivität auf kombinierten 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat-Magermilch-Agarmedien, während ein Klon in der Lage war, Phytat zu hydrolysieren. Für die Identifizierung von Oxidoreduktasen wurden Testverfahren eingesetzt, die auf dem Nachweis von Carbonylgruppen infolge der Oxidation des eingesetzten Substrates 1,2-Propandiol beruhen. Von den etwa 20000 getesteten Klonen zeigten 19 Transformanden eine Carbonyl-bildende Aktivität. Im Verlauf der Arbeiten zeichneten sich zwei Klone durch eine Braunfärbung aus, die vermutlich auf eine Katalase/Peroxidase- bzw. Aminolävulinsäure-Synthase-Aktivität zurückzuführen ist. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die in dieser Arbeit entwickelten Verfahren den Zugang zu einer erheblichen Anzahl an neuen Genen aus Mikroorganismen ermöglicht haben, die bisher noch nicht kultiviert worden sind.Item Open Access Surfaces for functional and patterned immobilization of proteins(2007) Stegmaier, Petra; Brunner, Herwig (Prof. Dr. )Functional and patterned immobilization of proteins onto solid substrates is an important issue in biotechnological processes involving protein purification or detection, or in the study of protein-protein interactions. This thesis presents a new strategy to functional immobilize proteins in selected microregions of a substrate based on photosensitive surface layers containing caged ligands and protein repellent EG chains. Special effort has been paid to the development of surface compositions and architectures that retain protein function in the surface mobilized state. In the first part of the thesis, branched silanes containing protein repellent OEG arms terminated with one inert -OMe group and one photocleavable, caged amino functionality were synthesized. Silica surfaces were modified with these molecules and the properties of the surface layers were characterized. According to the ellipsometric data, submonolayers with amino surface densities lower than in SAMs of thiols were obtained after optimization of the conditions for the surface reaction. The photolytic properties of the surfaces were analyzed. Irradiation of the surface at 355 nm cleaved the photoremovable cage and liberated the amino functionalities. These were then used to immobilize protein targets from solution after appropriate biofunctionalization. Reflectance Interference Spectroscopy (RIFS) was used to monitor and quantify protein binding. Low non-specific adsorption of proteins onto the surfaces as a consequence of the presence of EG chains was proven. Binding efficiencies were shown to be better than binding onto surface layers containing linear and shorter EG chains. For surface layers with similar architectures (either linear or branched) binding results correlate with the surface density of ligands. In the second part, silanes possessing different photocleavable groups able to be cleaved individually by using light of different wavelengths (NVoc and DEACM) were synthesized. UV measurements revealed that DEACM can be easily cleaved off upon UV irradiation at 412 nm, without damaging the NVoc group. The NVoc group can be removed at 345 nm. Surface layers containing a mixture of both groups were prepared and used for coupling two different fluorescent dyes to selected microregions of a surface. The expected fluorescence pattern was observed, confirming the possibility of generating complex chemical patterns by using different cages that can be independently addressed. In a last part of the thesis, magnetite nanoparticles were modified with mixed silane layers containing amino and OH/ OMe terminal groups in different molar ratios and connected to the surface by EG spacers with different lengths. The influence of the amine density and accessibility on the protein loading capacity of the nanoparticles has been analyzed. The optimum silane surface composition for maximum protein loading was identified.