Universität Stuttgart
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Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.