Universität Stuttgart
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Item Open Access Biosynthese von Carotinoiden mittels rekombinanten Mikroorganismen(2010) Beuttler, Holger; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Diese Arbeit entstand aus einem gemeinsamen Projekt des Instituts für technische Biochemie (ITB) und des Instituts für Industrielle Genetik (IIG) an der Universität Stuttgart. Während das Institut für Industrielle Genetik für die molekularbiologischen Arbeiten zuständig war, oblagen dem Institut für Technische Biochemie, die Kultivierung und die Analytik. In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Synthese von Carotinoiden in rekombinanten Pseudomonas putida KT2440 mit Zeaxanthin als Modellprodukt untersucht werden. Insbesondere sollten limitierende Schritte bei der Biosynthese identifiziert werden. Die Synthese der Carotinoide erfolgt dabei aus der zugefütterten Kohlenstoffquelle, meist Glucose. Aus dieser werden in mehreren Schritten die Vorstufen des Isoprens, das Isopentenylpyrophosphat (IPP) und das Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) gebildet. Aus den beiden Vorstufen wird im bakteriellen Isoprenkatabolismus nun über die Zwischenstufen Geranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat, Geranylgeranylpyrophosphat gebildet. Die zur Synthese der Carotinoide nötigen Enzyme werden durch Expression von einem Plasmid gebildet. Die Gene stammten aus dem natürlichen Carotinoidproduzenten Pantoea ananatis. Mit Hilfe dieser Enzyme wird dann das Tetraterpen Phytoen und aus diesem, nach einer mehrstufigen Einführung von Unsättigungen, das erste farbige Tetraterpen, das acylclische Lycopin gebildet. In weiteren Modifikationen können die Enden zum ß-Carotin zyklisiert und die Ringe schließlich zum Zeaxanthin hydroxyliert werden. Zur Hydroxylierung des ß-Carotins wurden die Cytochrom-P450-Monooxygenase CYP175A1 aus Thermus thermophilus und die beiden ß-Carotinhydroxylasen aus Pantoea ananatis (CrtZ) und Brevundimonas sp. SD212 (CrtZBrev) verglichen. CrtZBrev und CYP175A1 zeigten deutlich niedrigere Ausbeuten als CrtZ. Zur Analyse der gebildeten Produkte wurde eine Methode der HPLC etabliert und so angepasst, dass eine gute Trennung der Substanzen möglich war. Ferner wurde zur schnellen Untersuchung einer großen Zahl von Proben eine Methode der Dünnschichtchromatographie neu entwickelt. Als bei guter Ausbeute am einfachsten durchführbar erwies sich die Extraktion der Carotinoide mit Aceton. Es wurden Wiederfindungsraten > 97 % erhalten. Mehrere am IIG mit Hilfe der Transposonmutagenese erhaltene Mutanten zeigten eine höhere Transformationseffizienz als dem Wildtyp. Auch die produzierte Zeaxanthinmenge war größer. Die Mutante D7L3 (1,51 mg Zeaxanthin pro Gramm Biotrockenmasse) wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Beim Vergleich der beiden Vollmedien LB- und TB-Medium sowie dem Mineralmedium MEK zeigte sich, dass in TB-Medium mit Glycerin als zusätzlicher Kohlenstoffquelle mit 7,0 mg/g die mit Abstand höchste Zeaxanthinmenge hergestellt werden konnte. In LB-Medium lag die Ausbeute bei 1,3 mg/g und in MEK-Medium mit Glucose bei 2,5 mg/g. Die volumetrische Ausbeute war ebenfalls in TB-Medium mit 51,3 mg/l am höchsten. Bei LB- und MEK-Medium lag sie mit 2,2 mg/l beziehungsweise 1,7 mg/l deutlich niedriger. Während der Produktion stieg die Zeaxanthinmenge kontinuierlich an. Es wurden weiterhin ß-Carotin und ß-Cryptoxanthin in sehr geringen Mengen gefunden. Es konnten 0,1 mg/g ß-Carotin beziehungsweise 0,6 mg/g ß-Cryptoxanthin in TB-Medium gemessen werden. In LB- und MEK-Medium waren die Mengen noch niedriger. Andere Carotinoidvorstufen konnten nicht nachgewiesen werden. Aus den erhaltenen Daten kann abgeleitet werden, dass die Hydroxylierung den Engpass bei der Zeaxanthinsynthese darstellt, da hier die Zwischenstufen gefunden werden konnten, während die anderen Reaktionen ohne Akkumulierung von Zwischenstufen abliefen. Es konnte durch CD-Spektroskopie und chirale Dünnschichtchromatographie gezeigt werden, dass es sich bei dem in P. putida gebildeten Zeaxanthin um das (3R,3’R)-Isomer handelt. Das Expressionssystem wurde auch in E. coli verwendet. Die Ausbeute im besten Fall war hier aber deutlich niedriger und lag bei 2,4 mg/g. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute in P. putida D7L3 wurden verschiedene Additive zum Medium geprüft. Am vielversprechendsten erwies sich Lecithin. Ein Zusatz von 10 % Lecithin vermochte innerhalb von 24 Stunden die Zeaxanthinmenge um das 10,4fache auf 216 mg/g zu steigern. Die Hochskalierung vom Schüttelkolben in den 5 l-Fermenter war erfolgreich, die Ausbeute blieb jedoch hinter der im Schüttelkolben deutlich zurück. Außerdem wurde die Bildung von Alginat beobachtet. Dies führte dazu, dass die Kultivierung nach spätestens zwei Tagen abgebrochen werden musste. In TB-Medium wurden Zeaxanthinausbeuten von 20 mg/l, in Mineralmedium wurde eine Ausbeute von 1,2 mg/l erreicht. Wurden Teilernten durchgeführt, bei welchem die Hälfte des Mediums einmal täglich gegen frisches Medium getauscht wurde, konnte die Ausbeute auf 5,1 mg/l gesteigert und die Kultivierung über drei Tage geführt werden. Bei Teilernten war das Produkt auch mit Lycopin verunreinigt.