Universität Stuttgart
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Item Open Access Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27(1999) Lutz-Wahl, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.Item Open Access Overexpression and protein engineering of lipase A and B from Geotrichum candidum CMICC335426(1999) Catoni, Elisabetta; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im wachsenden Interesse an Produkten mit geringerem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt die Bedeutung der Lipase B von Geotrichum candidum, die eine hohe Spezifität für Fettsäureester von cis-D9 ungesättigten Verbindungen zeigt. Die Lipase B und die hochhomologe Lipase A aus Geotrichum candidum wurden erfolgreich in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, mit einer Ausbeute von 6-8 U/(ml Medium). Die Lipasen wurden funktionell und in hoher Ausbeute auch in Pichia pastoris exprimiert. Da ausschließlich die rekombinanten Proteine von dieser Hefe sekretiert werden, liegen die Proteine bereits in nahezu reiner Form im Medium vor. Die Fermentationen der rekombinanten Lipase B wurden unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Das beste Ergebnis (600.000 U/l Kultur der reinen Lipase B) wurde in einer Hochzelldichtefermentation in billigerem synthetischem Medium erzielt. Die rekombinanten Lipasen A und B wurden hinsichtlich Substratspezifität, Temperatur- und pH-Einfluß charakterisiert. Diese Eigenschaften sind ähnlich wie die der nativen Lipasen A und B von Geotrichum candidum. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B. Dazu wurden Zufallsmutagenese, Punktgerichtete-Mutagenese und Immobilisierung durchgeführt. Durch Zufallsmutagenese und Punktgerichtete-Mutagenese konnten keine Mutanten mit erhöhter Thermostabilität identifiziert werden, während die Immobilisierung auf jeder der verwendeten Matrixen zur Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B führte. Die Halbwertszeit des Enzyms bei einer Temperatur von 50 °C konnte von 30 Minuten für die gelöste Lipase auf bis zu mehreren Stunden für die immobilisierte gesteigert werden. Die Überexpression der Lipase B in Pichia pastoris ermöglicht zusammen mit der entwickelten Immobilisierungsmethode eine billige Nutzung des Enzyms in industriellem Maßstab, beispielsweise zur Modifikation der Zusammensetzung von Ölen.Item Open Access Erstellung einer Enzymbibliothek über gerichtete Evolution, Entwicklung von Assaysystemen zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken auf Epoxidhydrolaseaktivität, Aufreinigung einer Epoxidhydrolase aus Streptomyces antibioticus(1999) Zocher, Frank; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht durch Methoden der zielgerichteten Mutagenese und der gerichteten Evolution aus einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens und einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus eine Enzymvariante mit Epoxidhydrolaseaktivität zu erhalten. Um die katalytische Traide der Epoxidhydrolasen nachzuahmen wurde in beiden Enzymen das Serin im aktiven Zentrum gegen Asparaginsäure ausgetauscht und Mutationen über error-prone PCR eingeführt. Die Varianten wurden vereinzelt, die Bakterien in Mikrotiterplatten kultiviert und die Enzymvarianten exprimiert. Hierzu war die Entwicklung eines Assay notwendig. Als Assaysubstanzen fanden mit Chromophoren substituierte Epoxycarbonsäureester Verwendung. Dabei konnte bei diesen Varianten keine Epoxidhydrolaseaktivität nachgewiesen werden. Zum direkten Nachweis der Epoxidhydrolyse wurde ein Assay basierend auf der Reaktion von 4-(4´-Nitrobenyl)-pyridin mit einem Epoxid in Mikrotiterplatte entwickelt. Durch den Einsatz eines Lösungsvermittlers und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte die Epoxidhydrolyse in Gegenwart von ganzen Mikroorganismen oder Rohextrakt nachgewiesen werden. Dabei konnten in den erzeugten Enzymbibliotheken keine Epoxidhydrolase gefunden werden, allerdings konnte innerhalb der Gattung der Streptomyceten Epoxidhydrolasen identifiziert werden. Der Stamm mit der höchsten Epoxidhydrolaseaktivität (S. antibioticus Tü4) wurde fermentiert und die Epoxidhydrolase teilweise aufgereinigt. Verschiedene Epoxide (Styroloxid, 1,2-Decanoxid und 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester) wurden ganzen Zellen oder der angereinigten Epoxidhydrolase umgesetzt und die Umsetzungen gaschromatographisch verfolgt. Die Stabilität der Epoxidhydrolase in Gegenwart verschiedener Cosolventien wurde untersucht. Der Stamm zeigte eine hohe Aktivität gegenüber 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester und eine moderate Enantioselektivität (E=13) bei der Racematspaltung von Styroloxid.Item Open Access Die Lipase aus Rhizopus oryzae: Klonierung, Expression, Reinigung und Mutagenese eines industriell relevanten Enzyms für die Biokatalyse und die Strukturbestimmung(1999) Minning, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lipase aus Rhizopus oryzae (ROL) konnte in der Vergangenheit in E. coli erfolgreich in Form inaktiver Einschlußverbindungen exprimiert werden. Um daraus die aktive Lipase zu erhalten, musste diese durch eine teure und aufwendige Rückfaltungsprozedur renaturiert werden. Da die Hefe Pichia pastoris dafür bekannt ist, heterologe Proteine mit großen Ausbeuten zu exprimieren wurde sie zur Produktion der reifen ROL, sowie diverser Mutanten verwendet. Die Expression unter Kontrolle des methanol-induzierbaren Alkoholoxidase Promotors (AOX1) ergab wesentlich höhere Ausbeuten wie unter dem konstitutiv exprimierenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Promotor (GAP). Er stellte deshalb für weitere Arbeiten den Promotor der Wahl dar. Es folgten eine Reihe fermenatativer Studien in komplexem Vollmedium, wie auch in synthetischem Medium zur Erhöhung der Lipase Ausbeute. Dabei konnten sowohl der Sauerstoffeintrag, wie auch die Fütterungsrate als Schlüsselparameter bei der Ausbeute identifiziert werden. In einem optimierten Fermentationsprotokoll konnte die sechsfache Menge aktiver Lipase, verglichen mit Escherichia coli erreicht werden. Die Lipase aus den verschiedenen Kultivierungen in komplexem Medium konnte durch einen Konzentrierungs- und einen Chromatographieschritt bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Die ROL aus Pichia pastoris wurde biochemisch charakterisiert und die Eigenschaften mit denen der ROL aus Escherichia coli verglichen. Abgesehen von der erhöhten Thermostabilität der ROL aus P. pastoris verhielten sich die Enzyme aus beiden Expressionssystemen sehr ähnlich. Außerdem konnte eine Klasse von zufällig erzeugten Fusionspeptiden ausgehend von der Metallbindungsstelle der ATPase 439 von Helicobacter pylori zur Verwendung in der Metallafinitätschromatographie entwickelt werden. Durch High-Throughput Screening konnte ein Peptid identifiziert werden, welches gegenüber dem His-Tag verbesserte Eigenschaften aufwies.Item Open Access Entwicklung von Werkzeugen zur Darstellung und Durchmusterung von Proteinbibliotheken(1999) Enzelberger, Markus; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Die Zufallsmutagenese etabliert sich zunehmend als Methode zur Veränderung von Proteineigenschaften. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden zur automatisierten Erstellung und Durchmusterung von so erzeugten Proteinbibliotheken beschrieben. Um die Durchmusterung der Bibliotheken mit Roboterunterstützung durchführen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, welches die Vereinzelung der Mutanten in Mikrotiterplatten erlaubt. Zu diesem Zweck wurde ein Vektor konstruiert, welcher neben dem mutierten Gen noch das green fluorescent Protein (gfp) trägt. Mit diesem Vektor transformierte E. coli konnten bereits 3 Stunden nach Transformation mittels eines Zellsorters detektiert und in Kompartimente einer Mikrotiterplatte abgelegt werden, wo sie identisches Wachstums- und Expressionsverhalten zeigten. Für den Nachweis von Epoxidhydrolase-Aktivität wurde ein Assay auf Basis von p-(4-Nitrobenzyl)-pyridin entwickelt. Der Test wurde im robotergestützten Hochdurchsatzscreening einer Streptomyceten-Stammsammlung validiert. Es gelang damit allerdings nicht in einer durch rationale und Zufallsmutagenese erzeugten Proteinbibliothek einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus Epoxidhydrolase-Aktivität nachzuweisen. Ebenfalls durch Zufallsmutagenese wurden neue Peptide für die Metallaffinitätschromatografie entwickelt. Ausgehend von einer bekannten Metallbindungsstelle einer ATPase aus Helicobacter pylori wurde das Sequenzmotiv HxHxxxCxxC mittels wobble Primer Technik variiert und an das gfp fusioniert. Die so entstandene Proteinbibliothek wurde mittels eines Laborroboters in Mikrotiterplatten auf die Bindungseigenschaften an Metallaffinitätsmatrizen untersucht. Es wurden Affinitätspeptide mit gegenüber dem (His)6-Tag deutlich verbesserten Eigenschaften gefunden. Die breite Anwendbarkeit des Affinitätspeptids konnte am Beispiel der Aufreinigung einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus, die sowohl in E. coli als auch in Streptomyces lividans exprimiert wurde, gezeigt werden.Item Open Access Untersuchungen zur Regio- und Stereoselektivität von Lipasen durch computergestütztes Molecular Modeling und molekularbiologische Methoden(1999) Scheib, Holger; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Es wurde ein Modell entwickelt, mit dessen Hilfe die Stereoselektivität von mikrobiellen Lipasen bei der Hydrolyse von Triacylglyceriden und in sn-2 substituierten Analoga verstanden und vorhergesagt werden kann. Es wurde zwei Typen von Triacylglyceriden und Analoga untersucht: flexible Substrate mit einer frei drehbaren O'-C1' Ether beziehungsweise Esterbindung (Alkylether-, Benzylether-, Estersubstrat) sowie rigide Substrate mit einer N'-C1' Amid- (Amidsubstrat) beziehungsweise C1'-C2'-Doppelbindung (Phenylsubstrat). Molecular Modeling Studien wurden durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen Lipase und Substrat zu untersuchen. Lipase-Substrat Wechselwirkungen sind hauptsächlich repulsiv und sterisch und treten auf zwischen dem sn-2 Substituenten und fast ausschließlich dem C-terminalen Nachbar zum katalytisch aktiven Histidin (L258 in Rhizopus oryzae Lipase, ROL, und Rhizomucor miehei Lipase, RML, sowie L287 in Pseudomonas cepacia Lipase, PCL) beziehungsweise einem strukturell benachbarten Rest (F344 in Candida rugosa Lipase, CRL, und I290 in Candida antarctica Lipase B, CAL B). Diese sterischen Abstoßungen beeinträchtigen die Substratgeometrie. Ein Torsionswinkel, FO3-C3, im Substrat konnte identifieziert werden, der mit der experimentell ermittelten Stereoselektivität korreliert und eine Unterscheidung zwischen sn-1 und sn-3 hydrolysierten Triacylglyceriden und Analoga zuläßt. Ein Wert von FO3-C3 > 150° korreliert mit sn-1, FO3-C3 < 150° mit sn-3 Stereoselektivität. Das Modell wurde weiter verbessert und erweitert, indem Mutationen in ROL und PCL eingeführt wurden beziehungsweise für CRL und CAL B angewendet wurde. Das Modell gilt für alle untersuchten Lipase-Substrat-Komplexe. Der Torsionswinkel FO3-C3 korreliert mit den experimentell bestimmten Stereoselektivitäten. Weitere Untersuchungen erstreckten sich auf Wechselwirkungen der PCL mit g- und d-Lactonen und primären Alkoholen sowie die Regioselektivität von mikrobiellen.Item Open Access Lipase-katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride: Verfahrensoptimierung und Erzeugung selektiver Lipasemutanten durch gerichtete Evolution(1999) Schmid, Ulrike; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen die Lipase-Katalysierte Synthese strukturierter Triglyceride, zum anderen die Veränderung der Kettenlängenselektivität der slip1-Lipase aus C. rugosa durch gerichtete Evolution untersucht. Besonderes Interesse galt der Synthese von strukturierten Triglyceriden des ABA-Typs, die aufgrund ihrer symmetrischen Struktur zur Therapie von Fettabsorptionsproblemen wie z.B. Pankreasinsuffizienz eingesetzt werden können. Besonderes Interesse galt dabei der Synthese von 1,3-Dioleoyl-2-palmitoylglycerin (OPO), das in Säuglingsnahrung als Fettkomponente eingesetzt wird. Durch die Entwicklung eines Zweischrittverfahrens unter Berücksichtigung lebensmittelrechtlicher Aspekte gelang es, ABA-Triglyceride unter Verwendung von 1,3-regiospezifischen Lipasen in hoher Ausbeute und Reinheit zu synthetisieren. Die Zweischrittsynthese gliedert sich in eine Alkoholyse als ersten Reaktionsschritt, gefolgt von einer Veresterung im zweiten Reaktionsschritt. Das Zielprodukt der Alkoholyse, 2-MP, konnte durch Kristallisation sehr rein (> 95 %) mit einer Ausbeute von 82 % isoliert werden. Die regiospezifische Analyse mit Pankreaslipase ergab hochreines OPO mit 96 % Palmitinsäure in sn2-Position und 90 % Ölsäure in sn1(3)-Position. Im zweiten Teil der Arbeit wurde durch gerichtete Evolution die Kettenlängenselektivität einer synthetischen Lipase aus Candida rugosa verändert. Mittels error prone PCR wurde das slip1-Gen mutiert und durch Transformation in Saccharomyces cerevisiae in vivo recombiniert. Zur Identifizierung von gewünschten Mutanten wurde ein aus p-Nitrophenylestern unterschiedlicher Kettenlänge bestehender Assay entwickelt, wobei das durch Lipaseaktivität freigesetzte p-Nitrophenol bei 410 nm photometrisch detektiert wurde. Die selektierten sechs Klone wurden sequenziert und die Mutationen ausgewertet. Eine Mutante zeigte eine deutlich erhöhte Selektivität gegenüber Palmitinsäure und Stearinsäure im Vergleich zum Wildtyp.