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19991

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Publication Type: search.filters.UBSTyp.DissertationInstitute: search.filters.UBSInstitut.Institut für Technische BiochemieStart date: 1999End date: 1999Author: search.filters.author.Catoni, Elisabetta

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    ItemOpen Access
    Overexpression and protein engineering of lipase A and B from Geotrichum candidum CMICC335426
    (1999) Catoni, Elisabetta; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
    Im wachsenden Interesse an Produkten mit geringerem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt die Bedeutung der Lipase B von Geotrichum candidum, die eine hohe Spezifität für Fettsäureester von cis-D9 ungesättigten Verbindungen zeigt. Die Lipase B und die hochhomologe Lipase A aus Geotrichum candidum wurden erfolgreich in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, mit einer Ausbeute von 6-8 U/(ml Medium). Die Lipasen wurden funktionell und in hoher Ausbeute auch in Pichia pastoris exprimiert. Da ausschließlich die rekombinanten Proteine von dieser Hefe sekretiert werden, liegen die Proteine bereits in nahezu reiner Form im Medium vor. Die Fermentationen der rekombinanten Lipase B wurden unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Das beste Ergebnis (600.000 U/l Kultur der reinen Lipase B) wurde in einer Hochzelldichtefermentation in billigerem synthetischem Medium erzielt. Die rekombinanten Lipasen A und B wurden hinsichtlich Substratspezifität, Temperatur- und pH-Einfluß charakterisiert. Diese Eigenschaften sind ähnlich wie die der nativen Lipasen A und B von Geotrichum candidum. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B. Dazu wurden Zufallsmutagenese, Punktgerichtete-Mutagenese und Immobilisierung durchgeführt. Durch Zufallsmutagenese und Punktgerichtete-Mutagenese konnten keine Mutanten mit erhöhter Thermostabilität identifiziert werden, während die Immobilisierung auf jeder der verwendeten Matrixen zur Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B führte. Die Halbwertszeit des Enzyms bei einer Temperatur von 50 °C konnte von 30 Minuten für die gelöste Lipase auf bis zu mehreren Stunden für die immobilisierte gesteigert werden. Die Überexpression der Lipase B in Pichia pastoris ermöglicht zusammen mit der entwickelten Immobilisierungsmethode eine billige Nutzung des Enzyms in industriellem Maßstab, beispielsweise zur Modifikation der Zusammensetzung von Ölen.