Universität Stuttgart
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Item Open Access Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27(1999) Lutz-Wahl, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.