Universität Stuttgart
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Item Open Access The effects of low nitrate levels on the freshwater cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: construction of a bioreporter assay and molecular characterization by transcriptome and proteome analysis(2003) Mbeunkui, Flaubert; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Since a few decades the so-called blue algal blooms came to public awareness and their occurrence was more frequently reported. These blooms stem from the mass proliferation of some cyanobacterial species and they occur both in the sea as well as in fresh water. The exact reasons for this phenomenon have not been finally clarified, but nutrient availability, limitation and excess, has a proven influence. Some bioavailability patterns of P, N, S and Fe strongly promote cyanobacterial proliferation. Due to the negative effects of these blooms, i.e. severe neuro- and hepato-toxin release, a deeper understanding, prediction and monitoring are desirable. It was the aim of this work to develop and use biotechnological tools to fulfill this requirement. In order to avoid the problems associated with water blooms and to understand the behavior of these microorganisms at low nutrient concentration, an assay as an early warning system for monitoring of water blooms formation at low nitrate concentration was developed; and the analysis of the physiological change at the level of the transcriptome and proteome was performed. Starting with a cyanobacterial reporter strain, Synechocystis sp. strain PCC 6803 harboring PnblA::luxAB-kmR in its genome, a luminescent reporter assay for the detection of nitrate bioavailability was constructed. In this construction, luxAB gene encoding the luciferase, from the luminescent bacterium Vibrio harveyi was fused with the kanamycin resistance gene (kmR), leading to a luxAB-kmR gene complex. This gene complex was then fused with the nblA1 gene of Synechocystis and inserted in its chromosomal DNA. This reporter strain was designated N1LuxKm. The expression of the luxAB gene was induced by nitrate deficiency and was quantified by the bioluminescence emission. By means of immobilization of N1LuxKm in microtiter plates, the sensor was storable for about one month and showed a dose-dependent luminescence signal in a concentration range of 4-100 µM nitrate after a sample incubation time of 10 h under continuous illumination (50 µE.m-2.s-1 of white light). Combined with ecological and physiological data this sensor could be used as an early warning system for water blooms. In order to further understand cellular processes resulting from nitrate starvation and their influence on cyanobacterial blooms, the proteome dynamics of Synechocystis sp. PCC 6803 was analyzed through 2D gel electrophoresis, MALDI-TOF/MS of trypsin-digested protein fragments and N-terminal amino acid sequencing. This simultaneous analysis of total gene expression at the level of protein represents one of the premiere strategies for studying biological systems and understanding the relationship between various expressed genes and gene products. This approach allowed the identification of four proteins which were up-regulated under nitrate starvation conditions, namely two isoforms of "the nitrogen regulatory protein P-II" encoded by glnB gene; "the carbon dioxide concentrating mechanism protein" and the plastocyanin encoded by ccmK and petE genes respectively. The information gained with proteomics was confirmed and extended by RNA expression analysis related to nitrate depletion using oligonucleotide sequences immobilized on microarrays. Total RNAs were reverse transcribed to fluorescent-labeled cDNAs, then hybridized to the immobilized probes. The difference in the abundance of the transcripts was recorded through the difference in the fluorescence emission. All the genes, which encoded the proteins, identified with proteomics were up-regulated. nblA gene used for the construction of the reporter strain and the ntcA gene (found in the literature to be induced under nitrate deficiency) were also up-regulated whereas those encoding some units of the phycobilisomes were constantly expressed.Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.Item Open Access Entwicklung und Evaluierung von Assaysystemen zur Identifizierung des Substratspektrums von Epoxidhydrolasen, Aufreinigung und Charakterisierung einer Epoxidhydrolase aus Rhodococcus ruber DSM44319(2003) Doderer, Kai; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Das Ziel der Arbeit war die Suche nach neuen Epoxidhydrolasen (EC 3.3.2.3), die in rekombinanter Form als Biokatalysatoren verwendet werden können. Die Suche nach neuen Epoxidhydrolaseaktivitäten kann auf zwei Wegen erfolgen. Datenbanken, wie z. B. "GenBank", können auf DNA oder Protein Ebene durch Sequenzvergleiche mit Programmen, wie z. B. BLAST nach Sequenzen durchsucht werden, die bekannten Epoxidhydrolasen ähnlich sind. Im umgekehrten Fall kann eine unbekannte, aus einem Organismus isolierte Sequenz mit anderen verglichen werden und so die putative Funktion bestimmt werden. Im ersten Teil der Arbeit wurden drei putative Epoxidhydrolasen aus B. subtilis, C. glutamicum und M. charantia, die durch Sequenzvergleiche identifiziert wurden, untersucht. Durch die Analyse der Proteinsequenz kann nicht auf die Substratspezifität rückgeschlossen werden, deshalb musste die Funktionalität mit mehreren Epoxiden getestet werden. Dafür wurden zwei Produktnachweise in Mikrotiterplatten für vicinale Diole entwickelt. Der PSS (Periodatspaltung und Färbung mit Schiffschem Reagenz) und PSC (Periodatspaltung und Detektion mit Carboxyfluorescein) Assay. Mit dem PSS-Assay wurden die Produkte einer Periodatspaltung mit Pararosanilin in einer Farbreaktion nachgewiesen. Der PSS-Assay erlaubt den direkten Nachweis der 1,2-Diole in wässriger Lösung in Gegenwart von Zelllysaten. Der PSS-Test wurde mit vier Substrat/Produkt Kombinationen validiert. In allen Fällen konnte ein Diolgehalt von mindestens 5 µmol/ml sicher detektiert werden. Die Standardfehler lagen unter 8%. Mit dem PSC-Assay wurde das nach der Spaltung verbliebene Periodat mit Carboxyfluorescein nachgewiesen. Der PSC-Assay wurde mit sieben verschiedenen Epoxiden und ihren korrespondierenden 1,2-Diolen validiert und es konnten Standardfehler von unter 4 % und ein Detektionslimit von <1 µmol/ml bestimmt werden. Somit ist der PSC Test zum Variantenscreening geeignet. Mit diesen beiden Assaysystemen wurden die drei obengenannten, rekombinant in E. coli produzierten, Epoxidhydrolasen untersucht. Dabei konnte keine Epoxidhydrolaseaktivität gegen alle getesteten Epoxide nachgewiesen werden. L(+)-Weinsäure wird in einem Maßstab von 30000 t/a bei Preisen von 5 €/kg vorwiegend aus Rückständen der Weinerzeugung hergestellt. Die sich daraus ergebenden starken jahreszeitlichen Schwankungen machen eine von Naturstoff unabhängigen Zugang zu L(+)-Weinsäure attraktiv. R. ruber DSM44319 ist in der Lage cis-2,3-Oxirandicarbonsäure zu L(+)-Weinsäure zu hydrolysieren. Das für die Hydrolyse von cis-2,3-Oxirandicarbonsäure verantwortliche Enzym wurde aus R. ruber DSM44319 durch eine mehrstufige Aufreinigung mit einem Reinigungsfaktor von rund 450 isoliert. Das aufgereinigte Protein wurde charakterisiert und die Teile der Proteinsequenz bestimmt. Mit diesen Fragmenten konnte bei einer Datenbanksuche in den US Patenten eine Hydrolase aus R. rhodochrous LMPG-18079 gefunden werden, die dieselbe Reaktion katalysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die patentierte Protein- und DNA-Sequenz aus R. rhodochrous LMPG-18079 und R. ruber DSM44319 identisch sind. Proteinsequenzvergleiche zwischen der R. ruber Sequenz mit bekannten Epoxidhydrolasen zeigten keine Ähnlichkeit. Jedoch zeigt diese Sequenz eine hohe Ähnlichkeit mit vielen Halogencarbonsäure Dehalogenasen. Damit konnte gezeigt werden, dass die Hydrolase aufgrund ihrer Proteinsequenz als Halogencarbonsäure Dehalogenase (EC 3.8.1.5) einzustufen ist, obwohl sie in ihrer Funktionalität einer Epoxidhydrolase entspricht.Item Open Access Untersuchungen zur Enantioselektivität von Lipasen auf molekularer Ebene durch computergestütztes Molecular Modeling und molekularbiologische Methoden(2003) Gentner, Christian; Schmid; Rolf D. (Prof. Dr.)Die Enantioselektivität von mikrobiellen Lipasen bei der Hydrolyse und Veresterung von primären Alkoholen konnte in dieser Arbeit erstmals in ihren molekularen Zusammenhängen verstanden werden. Demnach beruht die Enantioselektivität auf sterischen Wechselwirkungen nur weniger Reste der Lipase mit hauptsächlich dem großen Substituenten des Substrats. Die Lipase von Pseudomonas cepacia (PCL) ist die einzige mikrobielle Lipase, die ein breites Spektrum an primären Alkoholen enantioselektiv umsetzt. Daher wurde diese zur Etablierung eines Computermodells, dem in silico Assay, verwendet. Molecular modeling Untersuchungen der entsprechenden PCL-Substrat-Komplexe wurden anhand von Substraten durchgeführt, deren Daten über die Enantioselektivität aus der Literatur entnommen wurden, um den in silico Assay zur Vorhersage der Enantiopräferenz von PCL gegenüber primären Alkoholen zu etablieren. Diese Untersuchungen zeigten, dass das bevorzugte Enantiomer tiefer als das nicht bevorzugte oder ausschließlich in einem bestimmten Strukturmotiv in der Bindungstasche, dem His gap, bindet. Diese Bewegung der Substrate in das His gap wird durch einen Torsionswinkel beschrieben. Da das bevorzugte Enantiomer sich in allen untersuchten Fällen tiefer in das His gap bewegt, ist der resultierende Torsionswinkel für dieses Enantiomer auch immer größer als für das nicht bevorzugte. Dadurch wird zum ersten Mal die Vorhersage der Enantiopräferenz für primäre Alkohole möglich. Zur Überprüfung dieses Modells wurden molecular modeling Untersuchungen für fünf weitere Substrate (Substrat A: 1,2-Propanediol; Substrat B: 1,2-Dodecanediol; Substrat C: 1-Phenyl-1,2-ethanediol; Substrat D: 2-Phenyl-1-propanol; Substrat E: Dihydro-5-(hydroxymethyl)-2(3H)-furanone) unternommen, für die bislang keine experimentellen Daten über die Enantioselektivität der PCL bekannt waren. Anhand des vorliegenden Modells konnte aufgrund der unterschiedlichen Bewegung der beiden Enantiomere der Substrate A-E ins His gap eine Vorhersage der Enantiopräferenz getroffen werden. Anschließend wurde Substrat E mit rekombinanter PCL umgesetzt, die Substrate und Produkte mit Hilfe der Gaschromatographie bestimmt und der resultierende E-Wert berechnet. Die richtige Vorhersage der Enantiopräferenz wurde für das Substrat E bestätigt. Da das Modell (in silico Assay) die Vorhersage der Enantiopräferenz der PCL-katalysierter Umsetzung primärer Alkohole erlaubt, erfolgte im nächsten Schritt die Ausweitung des Modells zum Verständnis und zur gezielten Vorhersage der Enantioselektivität PCL gegenüber dieser Substratklasse. Es konnte beobachtet werden, dass je tiefer sich das bevorzugte und je weniger tief sich das nicht bevorzugte Enantiomer in das His gap bewegten, desto größer war nicht nur die resultierende Differenz der Torsionswinkel des bevorzugten und des nicht bevorzugten Enantiomers, sondern auch der experimentell ermittelte E-Wert. Daher wurden in silico Mutanten der PCL gesucht, die eine deutliche Änderung der Differenz der Torsionswinkel Folge haben sollten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein Modell zur Vorhersage und Beschreibung der Enantioselektivität von Candida rugosa Lipase (CRL) gegenüber chiralen Carbonsäuren etabliert. Die Enantioselektivität der CRL bei der Veresterung dieser Substratklasse konnte somit ebenfalls erstmals vorhergesagt werden. Die Bindungstasche der CRL besteht aus einem hydrophobic dent, in dem der Alkoholrest bindet und einem hydrophobic tunnel, in dem die Säure bindet. Molecular modeling Untersuchungen zeigten, dass die Enantiopräferenz der CRL gegenüber Carbonsäuren anhand eines Torsionswinkels vorhergesagt werden kann. Dieser Torsionswinkel beschreibt die Bewegung des großen Substituenten am Stereozentrum in den hydrophobic tunnel und die des mittleren Substituenten in eine bestimmte Bindungstaschenregion, das acid his gap, das durch die Seitenketten der Aminosäuren F345 und H449 gebildet wird. Der große Substituent der beiden Enantiomere eines Substrates band beinahe identisch. Der mittlere Substituent des nicht bevorzugten Enantiomers eines chiralen Carbonsäuresubstrates bewegte sich jedoch tief in das acid his gap. Aus diesem Grund war der Torsionswinkel des bevorzugten Enantiomers (<100°) immer kleiner als der des dazugehörigen nicht bevorzugten (>300°). Die Bewegung des mittleren Substituenten des nicht bevorzugten Enantiomers in das acid his gap drückte die Seitenkette des katalytischen H449 weg. Die Enantioselektivität korrelierte mit dem Abstand zwischen katalytischem Histidin zum Sauerstoff der mit dem Substrat veresterten Alkoholgruppe des nicht bevorzugten Enantiomers dHNe-OAlk.Item Open Access Entwicklung hochsensitiver Biosensoren für neurotoxische Insektizide in Lebensmitteln : enzymatische in-vitro Aktivierung von Phosphorthionaten mit der Monooxygenase P450-BM3 und Sensitivitätssteigerung durch Proteindesign von Acetylcholinesterase(2003) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines sensitiven AChE-Biosensors für den quantitativ summarischen Nachweis neurotoxischer Organophosphate und Carbamate in Lebensmitteln und Säuglingsnahrung. Für die Untersuchung von Lebensmittelproben musste ein Verfahren entwickelt werden, welches unspezifische Matrixeinflüsse verhindert. Dies gelang durch Eingliederung einer Elektrodenbehandlung mit dem Tensid Tween 20 in das Testprotokoll. Dieser Schritt reduzierte die Probenvorbehandlung auf ein Minimum und lieferte ausgezeichnete Wiederfindungsraten von durchschnittlich 85% in den getesteten Lebensmittelproben. Der Biosensortest wurde mit Realproben vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart erfolgreich validiert. Die Anwendbarkeit konnte im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem CVUA Stuttgart gezeigt werden, in der Babybrei-Proben aus vier Ländern untersucht wurden. Hierbei wurden drei Überschreitungen des EU-Grenzwertes für Säuglingsnahrung festgestellt. Für Phosphorthionate konnte eine neuartige Aktivierungsmethode entwickelt werden. Phosphorthionate stellen den Hauptanteil der als Insektizide eingesetzten Organophosphate dar, sind in ihrer ursprünglichen Form dem AChE-Hemmtest aber nicht zugänglich. Die Dreifachmutante F87V, L188Q, A74G war im Gegensatz zum Wildtyp Cytochrom P450 BM-3 in der Lage, die Oxidation von Phosphorthionaten in die korrespondierenden starken AChE-Inhibitoren zu katalysieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC-MS/MS ergab eine quasi quantitative Umsetzung von Parathion und Chlorpyrifos zu Paraoxon bzw. Chlorpyrifos-oxon. Der indirekte Nachweis der enzymatisch aktivierten Phosphorthionate über die AChE-Hemmwirkung lieferte eine Transformationseffizienz von 85% für Parathion und 99% für Chlorpyrifos. Dieses Verfahren wurde erfolgreich in Lebensmittelproben getestet. Dies bedeutet eine deutliche Steigerung des Analytspektrums von AChE-Biosensoren. Die Sensitivität des AChE-Biosensors konnte durch Protein-Design von Nippostrongylus brasiliensis AChE gesteigert werden. Es wurden zehn Einfachmutanten und eine Mutante mit zusätzlicher Insertion von 26 Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese hergestellt und in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Ausbeute des Wildtyps konnte durch optimierte Kultivierungsbedingungen in einem 5L Fermenter auf 0,6 g/L gesteigert werden. Dieser Wert liegt deutlich über allen bislang erreichten Expressionsraten rekombinanter AChEn. Die AChE-Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber den 11 wichtigsten Organophosphaten und Carbamaten getestet. Die Mutation M301(288)A in der Acyltasche des aktiven Zentrums der AChE lieferte die insgesamt sensitivste Mutante. Gegenüber Omethoat ergab sich eine 108-fache Sensitivitätssteigerung. Die Sensitivität gegenüber Pirimiphos-methyl konnte ebenfalls um zwei Größenordungen gesteigert werden. Insgesamt konnte die Sensitivität gegen 10 von 11 getesteten Insektizide erhöht werden. Damit konnte das Ziel, Konzentrationen im Bereich des Pestizidgrenzwertes von Säuglingsnahrung von 10 µg/kg zu detektieren, für acht 8 der 11 getesteten Insektizide erreicht werden.