Universität Stuttgart
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Item Open Access Molecular modeling of hydrophobic effects in complex biomolecular systems : from simple mixtures to protein-interface aggregation(2014) Benson, Sven P.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Hydrophobicity is a term commonly used to discuss the formation of molecular structures in aqueous solution, and since water is ubiquitous in cellular systems, it may be applied in virtually every biomolecular context. Hydrophobicity is not a first-principle parameter but an abstract concept to describe the “behavior” of molecules in aqueous environments. The terminology of hydrophobicity is misleading, because it implies repulsion or a lack of attraction between nonpolar groups and water, when in fact attractive interactions persist due to atom dipoles. Although it has long been recognized that the driving force of structure formation in aqueous environments is founded in water’s “narcissism”, i.e., water self-preference, rather than in a general “fear of water”, the term hydrophobicity has established itself ever since Kautzmann related protein stability to hydrophobic interactions. Due to its false implications, hydrophobicity can be a cause of confusion and the culprit of misleading deductions. Presented in this dissertation is the author’s work on the structural and dynamical characterization of hydrophobic effects in biomolecular systems in the broadest sense, whereby molecular systems on three different size scales are covered: binary mixtures of methanol and water, aggregation of triglyceride droplets in aqueous solution and enzymes that interact with triglyceride-water interfaces of large-scale triglyceride aggregates.Item Open Access Zur Anwendbarkeit von Squalen-Hopen-Zyklasen als chirale Brønsted-Säuren in der asymmetrischen Katalyse(2014) Hammer, Stephan C.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die Anwendung von Enzymen und Mikroorganismen als Katalysatoren in der organischen Synthese hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als eine ernsthafte Ergänzung zur rein chemischen Katalyse etabliert. Jedoch ist die Bandbreite an biokatalytisch durchführbaren Reaktionen sehr gering. Für eine Vielzahl an synthetisch wertvollen Reaktionen wurden entsprechende Enzyme von der Natur nicht evolviert oder bisher nicht entdeckt. Die Entwicklung solcher Enzyme für die Katalyse nicht-physiologischer chemischer Transformationen ist ein zum größten Teil unerforschtes Arbeitsgebiet. Ein Ansatzpunkt ist die Nutzbarmachung bereits vorhandener enzymatischer Katalysezentren. Dies ist auch von besonders großer Bedeutung, da viele der in der organischen Chemie divers eingesetzten Aktivierungsmodi Bestandteil des enzymatischen Repertoires sind. Jedoch werden diese hoch-entwickelten enzymatischen Katalysezentren von der Natur häufig nur sehr spezialisiert eingesetzt und im Labor nur selten gezielt für nicht-natürliche Reaktionen entwickelt. In diesem Grenzgebiet, zwischen der organischen Synthesechemie und dem Enzymdesign, befindet sich der Fokus der hier vorliegenden Arbeit. Ziel war die Entwicklung einer Plattform für die enzymatische Brønsted-Säure-Katalyse. Dies ermöglicht einen potentiellen biokatalytischen Zugang zu einer Vielzahl an nicht-physiologischen, jedoch synthetisch wertvollen chemischen Transformationen, da die chirale Brønsted-Säure-Katalyse in der organischen Chemie zur Durchführung einer Vielzahl an wichtigen C-C-bindungsknüpfenden Reaktionen verwendet wird. Dieser Ansatz verbindet die leistungsstarke Brønsted-Säure-Katalyse mit den Vorteilen der Biokatalyse, namentlich den oft exzellenten Selektivitäten zusammen mit hohen Aktivitäten basierend auf einer Synthese in Wasser als „grüneres“ Lösungsmittel. Biokatalysatoren sind genetisch kodiert und lassen sich somit mikrobiell synthetisieren und einfach durch genetische Manipulation optimieren. Während die allgemeine Brønsted-Säure-Katalyse bei Enzymen eine wichtige Rolle spielt (z. B. bei der Stabilisierung von Übergangszuständen durch Bildung von Wasserstoffbrücken-bindungen) ist die enzymatische, spezifische Brønsted-Säure-Katalyse nicht beschrieben. Eine Ausnahme bilden hier die Squalen-Hopen-Zyklasen (SHCs), welche die kationische Polyzyklisierung von Squalen zu den pentazyklischen Produkten Hopen und Hopanol katalysieren. Zur Protonierung der terminalen C=C-Bindung des Substrates nutzen SHCs eine Asparaginsäure mit biologisch ungewöhnlich hoher Acidität. Während dieser Doktorarbeit wurde das katalytische Potential dieser einzigartigen Protonierungsmaschinerie studiert. In einem ersten Teil der Arbeit wurde das natürliche Reaktionsspektrum dieses katalytischen Zentrums (ausgestattet mit der hoch-aciden Asparaginsäure) untersucht. Durch die Verwendung verschiedener bioinformatischer Methoden wurden Proteinsequenzen evolutionär verwandter Enzyme ermittelt. Somit wurde eine Superfamilie an protonierenden Enzymen (Protonasen) identifiziert und bezüglich deren beschriebener Funktionen analysiert. Diese Studien zeigen, dass sich das Reaktionsspektrum dieser Protonase-Superfamilie in der Natur auf die Polyzyklisierung einiger weniger linearer Terpene beschränkt, ganz im Gegensatz zu der enormen Diversität Brønsted-Säure-katalysierter Reaktionen in der organischen Chemie. Das Substratspektrum der SHCs und dabei besonders des Enzymes aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurde in der Vergangenheit mehrfach adressiert, wobei sich die Studien auf Polyzyklisierungen Squalen-artiger Substratanaloga beschränkten. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Substratspektrum für Polyzyklisierungsreaktionen auf funktionalisierte Polyprenoide erweitert. Insbesondere wurde gezeigt, dass Aromaten und Amide als Nukleophile in der kationischen Polyzyklisierung verwendet werden können, um die Reaktionen zu terminieren. Somit sind formal die stereoselektive Friedel-Crafts-Alkylierung sowie die Hydroamidierung Bestandteil des Reaktionsportfolios der SHCs. Neben der AacSHC wurde in diesem Teil der Arbeit auch eine weitere SHC aus Zymomonas mobilis (ZmoSHC1) verwendet, wobei sich beide Enzyme nur minimal in ihren Funktionen unterschieden. Das Substratspektrum der SHCs ist bezüglich der Substratgröße beschränkt. Während sich mittelgroße Sesqui- und Diterpen-Derivate selektiv und mit guter Aktivität zu bi- und trizyklischen Verbindungen umsetzen lassen, werden Monoterpen-Derivate von den Wildtyp-Enzymen nicht zu den entsprechenden chiralen Cyclohexanoiden zyklisiert. Synthetisierte Modellsubstrate wurden in einem dritten Teil dieser Arbeit verwendet, um diese Limitierung zu untersuchen. Hierzu wurden die Aktivitäten bei enzymatischen Umsetzungen mit molekulardynamischen Simulationen verglichen. Somit wurde ein Zusammenhang zwischen der Substratbindung in einer reaktiven Konformation und der jeweiligen Aktivität aufgezeigt. Daraus lässt sich ableiten, dass vermutlich nicht die katalytische Maschinerie die SHCs auf die Polyzyklisierungschemie beschränkt, sondern die Struktur des hochselektiven aktiven Zentrums. Dieses aktive Zentrum diskriminiert nicht-natürliche Substrate durch die limitierte Fähigkeit diese in einer reaktiven Konformation zu binden. Um SHCs zu „Protonasen“ für unterschiedliche nicht-natürliche Reaktionen zu entwickeln, ist deshalb ein breites Set an unterschiedlichen Geometrien des aktiven Zentrums nötig. Dementsprechend lassen sich potentielle Substrate für unterschiedliche Reaktionstypen mit einer höheren Wahrscheinlichkeit in einer reaktiven Konformation binden. Jedoch sind die aktiven Zentren der SHCs und auch verwandter Triterpen-Zyklasen hochkonserviert. Die nötige Diversität an Enzymen lässt sich somit nicht aus dem natürlichen Pool an Katalysatoren rekrutieren. Aus diesem Grund wurde in einem vierten Teil der Arbeit eine Mutantenbibliothek der AacSHC erstellt. Mit einer rationalen Mutationsstrategie (hydrophobe Substitution) wurde die AacSHC zu einem Set an hochselektiven „Protonasen“ entwickelt und damit die Anwendbarkeit als chirale Brønsted-Säure in der asymmetrischen Katalyse untersucht. Die erzeugten Varianten zeigten Aktivitäten für unterschiedliche chemische Transformationen bei gleichzeitiger Protonierung verschiedener funktioneller Gruppen (Alken, Epoxid und Carbonyl). Dies ermöglichte die Darstellung interessanter Cyclohexanoide mit guten Aktivitäten und exzellenten Stereoselektivitäten (>99 % ee/de). Die praktische Anwendbarkeit wurde in semi-präparativen Umsetzungen aufgezeigt. So wurde zum Beispiel 512 mg Geraniol mit der Variante AacSHC G600F zu einem Cyclohexanoid umgesetzt (32 % isolierte Ausbeute). Demzufolge wurde durch die Einführung einer Punktmutation ein beinahe inaktives Wildtyp-Enzym zu einem praktisch anwendbaren Katalysator evolviert. Verdeutlicht werden die exzellenten Selektivitäten (Regio-, Stereo- und Produktselektivitäten) durch die exklusive Umsetzung von (S)-6,7-Epoxygeraniol aus dem entsprechenden Racemat (inklusive der regioselektiven Deprotonierung des Carbokation-Intermediates), die hochstereoselektive Synthese (>99 % de) von (-)-iso-Isopulegol aus (S)-Citronellal oder durch die stereoselektive Wasseraddition an das Carbokation-Intermediat der Zyklisierung von Geraniol. Der Ursprung der hohen Selektivitäten liegt in der Geometrie des aktiven Zentrums. Ausgehend von unterschiedlichen reaktiven Konformationen (welche zu unterschiedlichen Produkten führen können), werden die Substrate von den „Protonasen“ selektiv in einer bestimmten reaktiven Konformation gebunden und dadurch selektiv aktiviert. Zusammenfassend wurde die einzigartige Protonierungsmaschinerie der SHCs von der Polyzyklisierungschemie befreit und für nicht-natürliche Reaktionen in die asymmetrische Katalyse eingeführt. Darüber hinaus leistet diese Arbeit einen methodischen Beitrag in der Entwicklung neuer Biokatalysatoren, da sie aufzeigt, dass Enzyme und deren Katalysezentren systematisch für nicht-physiologische Reaktionen entwickelt werden können. Dies ist interessant für die Etablierung neuer Biosynthesewege sowie für die Erweiterung der Reaktionsportfolios in der organischen Synthese (Stichwort: chirale Brønsted-Säure-Katalyse in Wasser).Item Open Access Enzymatischer Zugang zu mittelkettigen Dicarbonsäuren(2014) Otte, Konrad B.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem alternativen biotechnologischen Zugang zu den interessanten Polymerbausteinen Azelainsäure und Sebacinsäure. Ausgehend von Linolsäure wird Azelainsäure in einer dreistufigen Multienzymkaskade hergestellt, welche auf dem pflanzlichen Oxylipinmetabolismus basiert. Die oxidative Spaltung wird durch eine 9-Lipoxygenase (St-LOX1, Solanum tuberosum) eingeleitet, welche Linolsäure mit molekularem Sauerstoff hydroperoxidiert. In einer Folgereaktion wird das entstandene 9-Hydroperoxid durch eine 9/13-Hydroperoxid-Lyase (Cs-9/13HPL, Cucumis sativus) in ein Aldehyd und eine 9-Oxosäure gespalten. In einem letzten Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) katalysierten Schritt wird die 9-Oxosäure 9-Oxononansäure zu Azelainsäure oxidiert. Der hierauf basierende entwickelte E. coli Stamm konnte, in einer Eintopfreaktion Linolsäure direkt zu Azelainsäure umzusetzen (29 mg/mL innerhalb von 8 h). Für die Herstellung von Sebacinsäure wurde mittels einer retrosynthetischen Analyse eine vierstufige artifizielle Multienzymkaskade, ausgehend von Ricinolsäure, entwickelt. Die zentrale C-C-Bindungsspaltung dieser Kaskade erfolgt durch eine de novo Retro-Aldolase (RA 110.4, Arzeda) katalysierte Reaktion. Das für diese Reaktion benötigte 1,3-Ketolmotiv wird zuvor in einer zweistufigen Enzymkaskade bereitgestellt. In einem ersten Schritt wird Ricinolsäure mittels einer Alkohol-Dehydrogenase (ADH-102, c-LEcta) zu 12-Oxoölsäure oxidiert und anschließend mit einer Oleat-Hydratase (Em-OAH1, Elizabethkingia meningoseptica) zu 10-Hydroxy-12-oxostearinsäure umgesetzt. Die durch die Retro-Aldolreaktion entstehende 10-Oxodecansäure wird in einem letzten Schritt analog zu der Oxidation von 9-Oxononansäure mithilfe einer Aldehyd-Dehydrogenase (As-ALDH1, Acinetobacter Stamm M-1) zu Sebacinsäure oxidiert. Die in vitro Multienzymkaskade konnte innerhalb von 26 h mit einer Gesamtausbeute von 10 % durchgeführt werden.Item Open Access Studies on variable surface loop regions of the ene reductase NCR from Zymomonas mobilis(2014) Reich, Sabrina; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The present work deals with the flavin-dependent ene reductases from the Old Yellow Enzyme family which catalyze a trans-hydrogenation of activated C=C double bonds with absolute stereospecificity due to the architecture of their active site. All family members possess as a structural backbone a barrel made of eight parallel beta-sheets, which are connected by loops with eight surrounding alpha-helices. Despite great structural and sequential similarities, the individual family members demonstrate significant differences in substrate specificity, thermostability and enantioselectivity. This fact leads to the question where the source of these different preferences of the individual ene reductases comes from. Comparing the amino acid composition as well as the spatial arrangement of the various family members, it is noticeable that the differences between these enzymes are located especially in so-called flexible beta/alpha loop regions on the surface of the catalytic interface. The central question of this work is the influence of these surface loop regions on enzyme´s properties and the evolutionary relationship and development of such loop regions within this enzyme family. In the first approach four beta/alpha loop regions between five selected ene reductases were shuffled by using the semi-rational Golden Gate Shuffling method. Based on a developed photometric activity assay, a total of five loop shuffling variants were selected for the characterization of the substrate spectrum. This characterization has shown that the random simultaneous shuffling of up to four surface loop regions resulted in enzyme variants demonstrating compared to wild type NCR an increased reduction activity towards standard substrates. In the second approach the family of the Old Yellow Enzymes was divided into five homologous subfamilies by using phylogenetic analysis based on the overall sequence identity. One of these subfamilies was investigated in more detail with regard on the occurrence, as well as the evolutionary relationship of surface loops. For this purpose two surface loops, Loop A and Loop B, in three different ene reductases were defined by a sequence-based secondary structure prediction. The generation of Hidden Markov loop profiles led to the conclusion that beta/alpha surface loops are composed of conserved, as well as variable amino acid positions and that individual family members can be assigned to certain loop profiles. Additionally to that Hidden Markov loop profiles pointed out that the presence of a common loop region at two different ene reductases is not depending on the overall sequence identity. Two widely related family members could exhibit the same loop profile. In the third approach the question, whether the loop length and/or the amino acid composition of a loop area possess a significant influence on the properties of an enzyme was addressed by the development of a rational loop design method. Therefore, a total of seven loop variants of the two structurally defined loop regions A and B of NCR from Z. mobilis were designed. The crystal structure determination of one of the loop grafting variants revealed that the exchange of loop regions led to changes that affect the complete enzyme structure. Furthermore, it was shown by the seven rational variants that both, the amino acid composition as well as the loop length of surface loops of TIM barrel proteins possess a significant effect on the properties of an enzyme. Thus, in contrast to Loop B changes in the Loop A region in length or amino acid composition led to a decreased stability of the enzyme. Additionally, it could be shown that it was possible to transfer properties of one enzyme to another by the grafting of surface loop regions, for example the cis/trans substrate specificity. In summary, the present work could demonstrate that TIM barrel based enzymes are able to tolerate large structural as well as sequential alterations within their surface loops without losing their catalytic activity. Based on the results obtained within this thesis it could be concluded that beta/alpha surface loop regions of Old Yellow Enzymes are representing "Enzyme Modifying Elements" that possess a significant influence on the properties of the entire enzyme. Furthermore, it was also shown for the first time that surface loops can be assigned to specific loop profiles consisting of conserved and variable regions. Based on the acquired understanding of the influence of loop regions on enzyme properties, it should in the near future be possible to create a tailor-made reductase with desired properties by rational loop design.Item Open Access Charakterisierung von Proteinen für die Biomineralisation von Hydroxylapatit(2014) Melcher, Melanie; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die später in Mundpflegeprodukten Anwendung finden können. Hierfür wurden 24 unterschiedliche Proteine bezüglich ihrer Bindeeigenschaften und ihrer Nukleationsaktivität gegenüber Hydroxylapatit bewertet. Die Untersuchung der Bindeeigenschaften erfolgte, nach Fluoreszenzmarkierung der Proteine, über Messung der Fluoreszenzintensitäten und über Fluoreszenzmikroskopie. Neben den Bindeeigenschaften wurden die 24 Proteine bezüglich ihrer Nukleationsaktivität gegenüber Hydroxylapatit bewertet. Hierfür wurden zwei Assays aus der Literatur angepasst. Ein Konstrukt wurde für weitere detaillierte Untersuchungen durch ortsgerichtete Mutagenese gewählt. In dieser Arbeit konnte diese Sequenz, innerhalb eines Fusionsproteins, schrittweise in ein biologisch aktives Motiv (SD) aus der Natur zurückgeführt werden.Item Open Access Untersuchungen zur Bestimmung des inhärenten katalytischen Potentials von Metall-bindenden Enzymen(2014) Wetzl, Dennis; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)In der hier vorgestellten Arbeit sollte, beispielhaft an zwei Modell-Systemen, untersucht werden ob und inwieweit man das katalytische Potential von Metalloenzymen nutzen kann, um alternative, sogenannte promiskuitive Reaktionen zu katalysieren. Dabei teilten sich die beiden Modell-Systeme, die Eisen-bindende Taurin Dioxygenase (TauD) und die artifizielle Kupfer-bindenen tHisF Varianten, eine HisHisAsp Triade als gemeinsames Strukturmotiv für die Koordination der Metallionen Eisen bzw. Kupfer. Es konnte gezeigt werden, dass die natürliche Hydroxylierungsreaktion der TauD genutzt werden kann, um Carbonsäuren, die strukturell ähnlich zu den natürlichen Substraten sind, in a-Position zu den entsprechenden a-Hydroxy-Carbonsäuren zu hydroxylieren. Dabei verlief die Hydroxylierung im Falle des Modellsubstrats b-Alanin mit guter Enantioselektivität zur Bildung von D-Isoserin mit einem ee-Wert von 96 % bei einem mäßigen Umsatz von 22,6 ± 0,7 %. Weiterhin konnten analoge w-Aminocarbonsäuren der Kettenlänge C4 - C6 mit dem TauD Wildtyp umgesetzt werden, wobei diese sowohl in Umsatz als auch ee-Werten der entsprechenden Produkte deutlich unter denen des b-Alanins lagen. Anhand Struktur-basierter Untersuchungen konnte eine Variante der TauD erstellt werden, welche sowohl in Bezug auf Umsätze (Steigerung des Umsatzes von b-Alanin von 22,6 ± 0,7 auf 54,2 ± 3,8 %) als auch Enantioselektivitäten (10 ± 1 % auf > 96 % bei g-Aminobuttersäure) bezüglich der getesteten Substrate signifikant verbesserte Eigenschaften gegenüber dem Wildtyp aufwies. Die Untersuchungen zur katalytischen Promiskuität zeigten, dass während TauD zur Katalyse alternativer Reaktionen wenig geeignet war und keine bzw. nur geringe Umsätze bezüglich der getesteten Modellreaktionen zeigte, tHisF mit zwei getesteten Modellreaktionen (der Michael-Addition und der Aldolreaktion) Umsetzungen zeigte. Jedoch konnte in weiterführenden Untersuchungen gezeigt werden, dass das artifizielle Metallzentrum der tHisF nicht an der Katalyse der entsprechenden Reaktionen beteiligt ist. So konnte im Falle der Michael-Addition gezeigt werden, dass die Reaktion weitgehend ohne Beteiligung des Enzyms sowie ohne Beteiligung des entsprechenden Metalls ablief. Die Aldolreaktion hingegen wird, analog zu entsprechenden Organokatalysatoren, von Lysin-Aminosäure-Seitenketten der tHisF katalysiert, welche sich an der Oberfläche des Enzyms befinden. Dies konnte anhand von Experimenten mit verschiedenen Varianten der tHisF, bei denen unterschiedliche mögliche reaktive Zentren per Mutagenese ausgeschaltet wurden, ermittelt werden.