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    Novel functions of aberrant cyclin D1/CDK4 activity in mantle cell lymphoma and consequences for proteasome inhibitor treatment
    (2022) Heine, Simon; Olayioye, Monilola (Prof. Dr.)
    Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive B cell-non-Hodgkin lymphoma with generally poor outcome and only transient responses to conventional chemotherapy. Cells of MCL patients are characterized by an aberrant high cyclin D1-driven cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) activity. Recently, the ubiquitin proteasome system (UPS) inhibitor bortezomib has been approved for the treatment of relapsed/refractory MCL and has shown promising results in first-line treatment of MCL patients. However, little is known about how the aberrant cyclin D1-driven CDK4 activity does affect the treatment efficacy of UPS inhibitors in MCL. The present work aimed to identify novel functions for cyclin D1/CDK4 activity in MCL that regulate the efficacy of proteasome inhibitor treatment. In this study, the efficacy of proteasome inhibitor treatment was found to depend on the aberrant cyclin D1/CDK4 activity in MCL. Inhibition of cyclin D1/CDK4 activity with the CDK4 inhibitor palbociclib antagonized bortezomib induced cell death in MCL cells. Moreover, the antioxidant defense protein sestrin 3 was identified to be strongly regulated by cyclin D1-driven CDK4 activity. Although, bortezomib efficacy was demonstrated to be regulated by reactive oxygen species (ROS) or antioxidants, changes in sestrin 3 expression levels are not responsible for cell death regulation after UPS blockage in MCL. Furthermore, even though targeting cyclin D1/CDK4 activity with palbociclib induces cell cycle arrest, changes in cell cycle distribution after cyclin D1/CDK4 inhibition also do not mediate the antagonizing effect on bortezomib induced cell death. Astonishingly, it could be demonstrated that cyclin D1/CDK4 inhibition antagonizes the bortezomib induced cell death through a reduction of NOXA protein accumulation. It could also be shown that this mechanism is not exclusive for the proteasome inhibitor bortezomib but also applies to other agents that depend on NOXA protein accumulation for efficient cell death induction in MCL cells. Importantly, results of the present study revealed that this regulation of NOXA protein levels by cyclin D1/CDK4 activity is not associated with a reduction of NOXA transcript levels but is mediated by the regulation of NOXA protein stability. This identified novel function of cyclin D1/CDK4 to regulate NOXA protein half-life in the presence of UPS blockage is mediated by the autophagic degradation machinery. This study identified, the regulation of autophagic activity as a novel cell cycle independent function of cyclin D1/CDK4 activity in MCL. In this context, it was demonstrated that inhibition of cyclin D1/CDK4 activity by palbociclib treatment induces autophagic activity in MCL. Cyclin D1/CDK4 and autophagic activity, however, are not linked by the common autophagy regulating pathways, AMP-activated protein kinase (AMPK) or ROS. In addition, genetic or pharmacological inhibition of autophagic activity reverses the palbociclib mediated antagonism on bortezomib induced cell death and NOXA protein accumulation. Remarkably, this study demonstrates that the NOXA protein can be targeted for proteasomal as well as autophagosomal degradation. Targeting NOXA protein for degradation through selective autophagy might be mediated through a LC3-interacting region (LIR) motif that was identified in the amino acid sequence of the NOXA protein. Interestingly, combination of bortezomib with known autophagy inhibitors potentiates cell death induction as well as NOXA protein accumulation compared to bortezomib treatment alone. Furthermore, screening for a highly efficient combinatorial blockade of the UPS and the ALP revealed that the fatty acid synthase (FASN) inhibitor orlistat can be repositioned for autophagy inhibition. Consequently, the combinatorial treatment with bortezomib and orlistat leads to a very efficient NOXA protein induction and caspase dependent cell death in MCL cells. This cell death is again dependent on the aberrant high cyclin D1/CDK4 activity. The expression levels of certain other apoptotic proteins, however, are not affected by the combinatorial treatment. In conclusion, the present study revealed the regulation of autophagic activity as a novel function of cyclin D1/CDK4 activity in MCL. These findings are of utmost importance for the treatment of MCL patients, as combination of proteasome inhibitors with autophagy inhibitors could greatly improve therapy outcomes or overcome bortezomib resistances. In addition to known autophagy inhibitors, treatment options could include conventional drugs that are repurposed for targeting the autophagic degradation machinery. On the other hand, care must be taken when combining proteasome inhibitors with other chemotherapeutics that might impair cyclin D1/CDK4 activity or induce autophagy.
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    Brought to light: the Bcl-2 transmembrane domain interactome elucidated by a bimolecular split luciferase assay and its impact on apoptosis signalling
    (2024) Beigl, Tobias B.; Morrison, Markus (Prof. Dr.)
    Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, die häufig bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs gestört ist. Ein Schlüsselereignis der Apoptose ist die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran (MOMP), die von der B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) Proteinfamilie gesteuert wird. Bcl-2-Proteine bilden ein komplexes Interaktionsnetzwerk, in dem sich pro- und anti-apoptotische Mitglieder gegenseitig zugunsten von Zelltod oder -Überleben hemmen. Das Netzwerk wird durch die Interaktion zwischen dem Bcl-2 Homologie 3 Motiv (BH3) und der hydrophoben Furche definiert. Eine neue Art von niedermolekularen Wirkstoffen, sogenannte BH3-Mimeticka, welche die hydrophobe Furche anti-apoptotischer Bcl-2 Proteine besetzen, ist wirksam in der Krebstherapie. Es verdichten sich jedoch Hinweise darauf, dass die weit weniger untersuchte C-terminale Transmembrandomäne (TMD) von Bcl-2 Proteinen, die traditionell als Membrananker fungiert, ebenfalls als Interaktionsfläche dienen kann. Zur weiteren Aufklärung der Interaktionen in der Bcl-2-Proteinfamilie über die TMD wurde ein zellbasierter Assay entwickelt und validiert, bei dem das mit TMDSequenzen fusionierte bimolekulare Luziferase-System NanoBiT mit gleichzeitiger Expression von Fluorophoren zur Signalnormalisierung kombiniert wird. Eine systematische Analyse der TMD-Interaktionen zwischen pro-apoptotischen Effektor-Bcl-2-Proteinen (BAX, BAK und BOK) und anti-apoptotischen Bcl-2-ähnlichen Proteinen (BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL-1 und A1) offenbarte homotypische Interaktionen zwischen Effektor-TMDs und Interaktionen von Effektor-TMDs mit BCL-XL-TMD und BCL-W-TMD. Interessanterweise wurde eine bisher unbekannte Interaktion von BOK-TMD und BCL-2-TMD identifiziert. Die subzelluläre Lokalisierung Fluorophor-konjugierter TMD-Peptide verdeutlichte, dass einige TMDs präferentiell in Mitochondrien (BAX, BAK, BCL-XL, BCL-W) lokalisiert sind, während andere (BOK, BCL-2, MCL-1) vorwiegend mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) kolokalisiert sind. TMD-Austausch und Mutation in BAX bestätigten eine wichtige Rolle der BAX-TMD bei der BAX-Inhibition, während der TMD-Austausch in BAK einen vernachlässigbaren Einfluss auf die BAK-Regulierung durch BCL-2 hatte. Darüber hinaus hingen sowohl die Kolokalisierung von BOK und BCL-2 als auch die Hemmung des durch BOK-Überexpression induzierten Zelltods durch BCL-2 von den TMD Sequenzen ab. Dementsprechend modulierte TMD-Mutation von BCL-2 die Interaktion mit BOK-TMD, die subzelluläre Lokalisierung und die anti-apoptotische Kapazität von BCL-2. Letztlich steigerte die Abwesenheit von BCL-2 den BOK-abhängigen ER-Stress-induzierten Zelltod, was auf einen physiologischen Kontext für die funktionelle Bedeutung ihrer TMD-Interaktion hinweist. Somit hebt diese Arbeit hervor, dass die Aufklärung des Bcl-2-TMD-Interaktoms für unser Verständnis der Apoptose-Regulation wichtig ist und ebnet den Weg für zukünftige Untersuchungen der TMD als Ziel für klinische Interventionen.
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    Die Rolle der Mitochondrien für den Cisplatin induzierten Zelltod von Ovarialkarzinomen
    (2021) Kleih, Markus; Olayioye, Monilola (Prof. Dr.)
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    Genexpressionsprofile follikulärer Lymphome und ihre prognostische Relevanz
    (2016) Staiger, Annette M.; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)
    Das Follikuläre Lymphom (FL), ein indolentes B-Zell Non-Hodgkin Lymphom, hat einen heterogenen klinischen Verlauf. Einige Patienten sterben nur wenige Monate nach Diagnosestellung, während andere bis zu 20 Jahre überleben. Wichtig für die Therapieentscheidung, die von „watch and wait“ über Strahlentherapien, kombinierte Chemotherapien bis hin zur autologen und allogenen Stammzelltransplantation reicht, ist daher eine möglichst exakte Einschätzung der Prognose. Um diese Einschätzung vornehmen zu können, wurde anhand verschiedener klinischer Parameter der „Follicular Lymphoma International Prognostic Index“ (FLIPI) entwickelt. Für die Wahl der Therapie wird jedoch bis heute nur die klinische Stadieneinteilung, basierend auf der Ann Arbor-Klassfikation, herangezogen. Während in den frühen Stadien ein kuratives Therapieziel besteht, wird in den fortgeschrittenen Stadien ein zytoreduktives, palliatives Ziel verfolgt. Neben klinischen Parametern konnten innerhalb des letzten Jahrzehnts molekularbiologische Parameter mit der Prognose des FL assoziiert werden. Mittels Genexpressionsanalysen wurde die Immune Response Signatur entwickelt, die eine erfolgreiche Risikostratifizierung für das FL beschreibt. Diese Signatur konnte bisher jedoch nicht bestätigt werden und erfordert den Einsatz von Frischgewebe, das im diagnostischen Alltag im Normalfall allerdings nicht zur Verfügung steht. Eine Genexpressions-basierte Risikostratifizierung des FL, die auch an Formalin-fixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe durchführbar ist, ist daher von größtem Interesse. Mit der NanoString®-Plattform steht eine Technologie zur Verfügung, die eine sehr sensitive, reproduzierbare Analyse von gezielt ausgewählten Genen an FFPE-Gewebe ermöglicht. Für die vorliegende Studie wurden 184 Kandidatengene ausgewählt, die bereits mit der Prognose (einschließlich der Gene der Immune Response Signatur) und Progression im FL assoziiert beschrieben wurden. Für die Analyse stand FFPE-Gewebe von Patienten zur Verfügung, die im Rahmen der prospektiven, randomisierten Therapiestudien der Deutschen Lymphomstudien (GLSG) behandelt wurden. Diese Kohorten zeichnen sich durch große Fallzahlen (frühe, lokalisierte Stadien (n = 255), fortgeschrittene, systemische Stadien (GLSG1996, 2000: n = 1223)), ein einheitliches Behandlungsregime und eine präzise Dokumentation der klinischen Daten aus. Nach erfolgreicher Etablierung der NanoString®-Technologie wurde die Genexpression der ausgewählten Kandidatengenen in insgesamt 870 verfügbaren Fällen der GLSG-Therapiestudien gemessen und statistisch ausgewertet. Eine prognostisch relevante Gensignatur konnte bei Patienten mit fortgeschrittenen FL nicht etabliert werden. Außerdem konnte auch die bereits beschriebene Immune Response Signatur nicht bestätigt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sich die Genexpression von FL in frühen und fortgeschrittenen Stadien signifikant unterscheidet. Mittels logistischer Regressionsmodelle konnten zwei Signaturen generiert werden, die eine präzise Vorhersage des Stadiums ermöglichen. Von besonderem Interesse hierbei ist, dass sowohl innerhalb der frühen Stadien Fälle mit einer Signatur gemäß der fortgeschrittenen Stadien als auch in den fortgeschrittenen Stadien Fälle mit einer Signatur gemäß der frühen Stadien identifiziert werden konnten. Die Fälle der fortgeschrittenen Stadien mit einer Signatur gemäß früher Stadien weisen signifikant weniger betroffene Lymphknoten auf. Des Weiteren ist bei diesen Patienten die Zeit bis zum Therapieversagen bzw. das Gesamtüberleben deutlich verlängert. Da in frühen Stadien der FL-Erkrankung ein kurativer Therapieansatz besteht, könnte die über diese Signaturen identifizierte Patientengruppe von einem kurativen Behandlungsansatz (in der Regel eine Radiotherapie) profitieren.