Universität Stuttgart
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Item Open Access Simulation von Mehrphasenvorgängen in porösen Medien unter Einbeziehung von Hysterese-Effekten(1999) Sheta, Hussam; Helmig, Rainer (Prof. Dr.)Die vorliegende Arbeit entstand im Rahmen des Forschungsprogramms der Versuchseinrichtung zur Grundwasser- und Altlastensanierung VEGAS. Sie beschäftigt sich mit einem zentralen Thema zur Beschreibung von Transport und Schadstoffausbreitung im natürtlichen Untergrund.Item Open Access Der mikrobielle Abbau von Etherverbindungen unter besonderer Berücksichtigung von Aralkyl- und Alkylethern(1999) Kim, Yong-Hak; Engesser, K.-H. (Prof. Dr. rer. nat. habil.)Die meisten Aralkylether- und Alkylether-abbauenden Stämme gehörten zu Rhodococcus. Die zwei Rhodococcus Stämme DEOB100 und DEOB200 bauten durch eine O-Dealkylierungsreaktion 1,4-Diethoxybenzol, 1,3- und 1,4-Dimethoxybenzole ab. Die Rhodococcus Stämme St127 und DEE5151 bauten jeweils nach der Anzucht mit Anisol oder Phenetol Aralkylether via 1-Hydroxy-2-Alkoxybenzole ab. Der mit Diethylether angezogene Stamm DEE5151 setzte dazu diese Chemikalien durch eine O-Dealkylierungsreaktion zu Phenol um. Der bisher taxonomisch nicht klassifizierte Stamm MOB600, der ein breites Substratspektrum an substituierten Benzolen und Phenolen wie z.B. Benzol, Toluol, Styrol, Anisol, Phenetol, o/m/p-Kresole, 2-Methoxyphenol und 3-Methoxyphenol sowie an Biphenyl besaß, wies eine primäre Dioxygenierungsreaktion zum Abbau von Aralkylethern hin. Der aliphatische Alkylether-abbauende Stamm DEE5151 besaß ein breites Substratspektrum an aliphatischen Alkylethern, Phenetol und Dibenzylether. Während seines Wachstums mit geeignetem Ether (z.B. Diethylether) wurden die O-Dealkylase und die Alkohol-Oxidase induziert. Ethylvinylether und Glutaraldehyd hemmten spezifisch die beiden O-Dealkylase und Alkohol-Oxidase. Aus den Hemmexperimenten damit wurde festgestellt, daß die beiden Enzymsysteme während des Stoffwechsels von Diethylether zusammenwirkend aktiv sind. Aus den vergleichenden Untersuchungen mit den Dibenzylether-abbauenden Sphingomonas Stämmen BZE101 und BZE102 her, wird bestätigt, daß die O-Dealkylase vom Stamm DEE5151 bevorzugt ein O-Methylen-C-Atom attackierte. Im Vergleich dazu ergaben die cyclische Alkylether-abbauenden Stämme THF100 und THF400 ein unterschiedliches Oxidationsmuster mit cyclischen, aliphatischen und halogenierten Alkylethern. Daraus wurde hypothetisch postuliert, daß die THF-Hydroxylase nur cis-Rotationsisomer von Diethylether, das der Struktur von Tetrahydrofuran ähnelt, spezifisch oxidieren kann.Item Open Access Präparative Studien in den Mehrstoffsystemen Selten-Erd-Metall - Selen bzw. Tellur und Sauerstoff(1999) Weber, Frank; Schleid, Thomas (Prof. Dr.)Mit SeO2 und TeO2 wurden zwei Sauerstoffquellen in die Selten-Erd-Chemie eingebracht, welche die Umgehung der reaktionsträgen Selten-Erd-Oxide ermöglichen. Alkalihalogenidschmelzen als Flußmittel verbesserten die Kristallqualität. Typisch für die Oxidchalkogenide sind in M10OSe14 (M = La - Nd, Pr10OSe14-Typ, I41/acd) isoliert vorliegende, in Pr2OSe2 (Tb2OS2-Typ, P21/c) über Kante zu Doppeln und über Ecken weiter zu Schichten verknüpfte [OM4]-Tetraeder. Die Verntezung wächst mit dem Oxidanteil. In M2O2Se (M = La - Lu, Y, Ce2O2S-Typ, P-3m1) werden drei cis-ständige Kanten und vier Ecken zur Bildung von Doppelschichten genutzt. Die Verbindungen A-M2O2Te (M = La - Ho, anti-ThCr2Si2-Typ, I4/mmm) und B-M2O2Te (M = Ho, Er) besitzen Doppelschichten, in denen vier Kanten zur Verknüpfung der Tetraeder herangezogen werden. Vergleichbare Doppelschichten findet man auch in Verbindungen des Formeltyps M4O4Se3 (M = Pr, Amm2) in denen die Trennschicht aus Selenid und Diselenid besteht. Reagieren die Oxidtelluride M2O2Te mit SiO2, so entstehen die Telluridsilicate A-M2Te[SiO4] (M = La - Nd, Nd2Se[SiO4]-Typ, Pbcm) und B-M2Te[SiO4] (M = La - Pr, Ce2Te[SiO4]-Typ, P21/c) geringerer Dichte. In den Selten-Erd-(III)-Oxotelluraten(IV) M2Te4O11 (M = Ho, Nd2Te4O11-Typ, C2/c) liegen Schichten aus über Kanten netzartig verknüpften [MO8]-Polyedern vor die beim Übergang zu M2Te5O13 (M = Ho, P-1) zu Bändern aufgelöst werden. In M2Te2O7 (M = Pr, Pyrochlor-Typ, Fd-3m) weisen die [MO8]-Polyeder die bisher höchste, dreidimensionale Verknüpfung auf. Die Struktur kann beschrieben werden als Interpenetration einer gamma-FeF3-isotypen anionischen und einer anti-beta-Cristobalit isotypen kationischen Teilstruktur. Bemerkenswert ist weiterhin, daß das freie Elektronenpaar (lone pair) am Te4+-Kation, im Gegensatz zu den beiden anderen untersuchten Selten-Erd(III)-Oxotellurat(IV)-Formeltypen stereochemisch nicht aktiv ist.Item Open Access Selektive Hydroxylierung von alpha- und beta-Ionon durch Streptomyces Stämme und molekulargenetische Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung der Ionon-Hydroxylase aus Streptomyces fradiae Tü 27(1999) Lutz-Wahl, Sabine; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit sollten α- bzw. β-Ionon durch selektive Hydroxylierung mittels Mikroorganismen zu 3-Hydroxyiononen umgesetzt werden, um einen Baustein für die chemisch-enzymatische Synthese von Astaxanthin und Zeaxanthin zu liefern. Über 200 Streptomyceten-Stämme wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β- und/oder α-Ionon regio- und stereoselektiv zu den jeweiligen 3-Hydroxy-Derivaten umzusetzen. Mit β-Ionon als Substrat zeigten 19 Stämme Umsetzung zu 4-Hydroxy- und nicht zum gewünschten 3-Hydroxy-β-ionon. Unter diesen 19 Stämmen setzten sechs α-Ionon zu 3-Hydroxy-α-ionon um. S. fradiae Tü 27 zeigte mit 75 % die größte Umsatzrate. Aufgrund von GC- und NMR-Daten konnte gezeigt werden, daß die Hydroxylierung von racemischem α-Ionon [(6R)-(-) / (6S)-(+)] nur die Bildung der zwei Enantiomere (3R,6R)- und (3S,6S)-Hydroxy-α-ionon ergab. Die enzymatische Hydroxylierung von α-Ionon durch die getesteten Streptomyceten-Stämme findet sowohl mit einer hohen Regio- als auch mit einer hohen Stereoselektivität statt. Um die Gene, die für diese Hydroxylase kodieren, zu isolieren, wurden P450-Genfragmente aus S. fradiae Tü 27 amplifiziert und sequenziert. Hier konnten zwei P450 Genfragmente identifiziert werden. Die Isolierung der vollständigen P450-homologen Gene mit unterschiedlichen Methoden gelang jedoch nicht. Um nun eine Aussage darüber treffen zu können, ob eines der beiden P450-Genfragmente aus dem Stamm Streptomyces fradiae Tü 27 die Hydroxylase kodiert, die die selektive Hydroxylierung des α-Ionons katalysiert, wurden die P450 homologen Gene durch Integrationsmutagenese inaktiviert. Die Mutanten wurden für die Umsetzung von α-Ionon eingesetzt. Während mit der Integrationsmutante GMP450-27Q eine Umsetzung zu 3-Hydroxy-α-ionon stattfand, allerdings mit Nebenprodukt, konnte mit GMP450-27P keine selektive Hydroxylierung zu 3-Hydroxy-α-ionon nachgewiesen werden. Somit scheint P450-27P für die selektive Hydroxylierung von α-Ionon verantwortlich zu sein.Item Open Access Overexpression and protein engineering of lipase A and B from Geotrichum candidum CMICC335426(1999) Catoni, Elisabetta; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im wachsenden Interesse an Produkten mit geringerem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt die Bedeutung der Lipase B von Geotrichum candidum, die eine hohe Spezifität für Fettsäureester von cis-D9 ungesättigten Verbindungen zeigt. Die Lipase B und die hochhomologe Lipase A aus Geotrichum candidum wurden erfolgreich in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, mit einer Ausbeute von 6-8 U/(ml Medium). Die Lipasen wurden funktionell und in hoher Ausbeute auch in Pichia pastoris exprimiert. Da ausschließlich die rekombinanten Proteine von dieser Hefe sekretiert werden, liegen die Proteine bereits in nahezu reiner Form im Medium vor. Die Fermentationen der rekombinanten Lipase B wurden unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Das beste Ergebnis (600.000 U/l Kultur der reinen Lipase B) wurde in einer Hochzelldichtefermentation in billigerem synthetischem Medium erzielt. Die rekombinanten Lipasen A und B wurden hinsichtlich Substratspezifität, Temperatur- und pH-Einfluß charakterisiert. Diese Eigenschaften sind ähnlich wie die der nativen Lipasen A und B von Geotrichum candidum. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B. Dazu wurden Zufallsmutagenese, Punktgerichtete-Mutagenese und Immobilisierung durchgeführt. Durch Zufallsmutagenese und Punktgerichtete-Mutagenese konnten keine Mutanten mit erhöhter Thermostabilität identifiziert werden, während die Immobilisierung auf jeder der verwendeten Matrixen zur Erhöhung der Thermostabilität der Lipase B führte. Die Halbwertszeit des Enzyms bei einer Temperatur von 50 °C konnte von 30 Minuten für die gelöste Lipase auf bis zu mehreren Stunden für die immobilisierte gesteigert werden. Die Überexpression der Lipase B in Pichia pastoris ermöglicht zusammen mit der entwickelten Immobilisierungsmethode eine billige Nutzung des Enzyms in industriellem Maßstab, beispielsweise zur Modifikation der Zusammensetzung von Ölen.Item Open Access Zwischen Kunstwerk und Nutzwert: die Architekturzeichnung, gesehen von Kunst- und Architekturhistorikern seit 1850(1999) Baus, Ursula; Kimpel, Dieter (Prof. Dr.)Thema ist die Entwicklung des Interesses, das Kunst- und Architekturhistoriker der Architekturzeichnung entgegengebracht haben. Es beginnt mit den Begriffen zur Architekturzeichnung, die im Vorfeld der Kunstgeschichtsschreibung auftreten, von Italien über Frankreich bis ins 18. Jahrhundert den deutschen Sprachraum erreichen und im wesentlichen auf die vitruvianischen Begriffe zum Zeichnen basieren. Die eigentliche Geschichtsschreibung der Architekturzeichnung beginnt im Schatten von (Hand-)Zeichnungs- und Architekturgeschichte - ihre Etappen lassen sich jedoch thematisch immer deutlicher fassen und als Leistungen einzelner Kunst- und Architekturhistoriker erkennen. Geschichte und Systematik im Zusammenhang mit idealen Vorstellungen von Architektur kennzeichnen das Werk Heinrichs von Geymüller, dem Pionier der Architekturzeichnungs-Geschichtsschreibung. Eine Geschichte der Architekturzeichnung im Überblick liefern in frühen Ansätzen Reginald Blomfield, James Burford und Martin Briggs, während der theoretische Überbau erst 1931 von Carl Linfert und – praxisnäher - von Dagobert Frey erarbeitet wird. Die Graphologie als reine Zeichnungswissenschaft, 1937 von Bernhart Degenhart entwickelt, findet in der Geschichtsschreibung der Architekturzeichnung keine Entsprechung. Der Architekturzeichnung wird vor allem durch die phantastischen, utopischen und alternativen Inhalte eine Art »Autonomie« neben der Architektur zuerkannt; die Themen in der Auseinandersetzung mit ihr werden vielfältiger, was an Beispielen aus der Antike und des 13. Jahrhunderts deutlich wird. Als erste Entwicklungsgeschichte der Architekturzeichnung kann die Publikation von Winfried Nerdinger (1984) gelten. Von der wachsenden Bedeutung des Ausstellungswesens profitieren seit den siebziger Jahren auch Architektur und Architekturzeichnung. Die heute über hundert Architekturarchive und -museen arbeiten in der ICAM an einer computergerechten Archivierungssystematik für die wissenschaftliche Arbeit.Item Open Access Erstellung einer Enzymbibliothek über gerichtete Evolution, Entwicklung von Assaysystemen zur Durchmusterung von Enzymbibliotheken auf Epoxidhydrolaseaktivität, Aufreinigung einer Epoxidhydrolase aus Streptomyces antibioticus(1999) Zocher, Frank; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht durch Methoden der zielgerichteten Mutagenese und der gerichteten Evolution aus einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens und einer Lipase aus Bacillus thermocatenulatus eine Enzymvariante mit Epoxidhydrolaseaktivität zu erhalten. Um die katalytische Traide der Epoxidhydrolasen nachzuahmen wurde in beiden Enzymen das Serin im aktiven Zentrum gegen Asparaginsäure ausgetauscht und Mutationen über error-prone PCR eingeführt. Die Varianten wurden vereinzelt, die Bakterien in Mikrotiterplatten kultiviert und die Enzymvarianten exprimiert. Hierzu war die Entwicklung eines Assay notwendig. Als Assaysubstanzen fanden mit Chromophoren substituierte Epoxycarbonsäureester Verwendung. Dabei konnte bei diesen Varianten keine Epoxidhydrolaseaktivität nachgewiesen werden. Zum direkten Nachweis der Epoxidhydrolyse wurde ein Assay basierend auf der Reaktion von 4-(4´-Nitrobenyl)-pyridin mit einem Epoxid in Mikrotiterplatte entwickelt. Durch den Einsatz eines Lösungsvermittlers und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte die Epoxidhydrolyse in Gegenwart von ganzen Mikroorganismen oder Rohextrakt nachgewiesen werden. Dabei konnten in den erzeugten Enzymbibliotheken keine Epoxidhydrolase gefunden werden, allerdings konnte innerhalb der Gattung der Streptomyceten Epoxidhydrolasen identifiziert werden. Der Stamm mit der höchsten Epoxidhydrolaseaktivität (S. antibioticus Tü4) wurde fermentiert und die Epoxidhydrolase teilweise aufgereinigt. Verschiedene Epoxide (Styroloxid, 1,2-Decanoxid und 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester) wurden ganzen Zellen oder der angereinigten Epoxidhydrolase umgesetzt und die Umsetzungen gaschromatographisch verfolgt. Die Stabilität der Epoxidhydrolase in Gegenwart verschiedener Cosolventien wurde untersucht. Der Stamm zeigte eine hohe Aktivität gegenüber 2,3-Epoxy-3-phenyl-propionsäureethylester und eine moderate Enantioselektivität (E=13) bei der Racematspaltung von Styroloxid.Item Open Access Autotrope Signaltransduktion durch membranständigen Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)(1999) Haas, Elvira; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Der Tumor Nekrose Faktor (TNF) ist ein pleiotropes Zytokin, das an der Vermittlung einer Vielzahl verschiedener zellulärer Antworten beteiligt ist. Die überwiegende Mehrzahl biologischer Antworten wird durch die Bindung von TNF an TNF-Rezeptor Typ 1 (TNF-R1) vermittelt. Es sind 2 bioaktive Formen von TNF beschrieben worden: Die membranständige Form des TNF-Moleküls und eine lösliche Form dieses Zytokins, die durch proteolytische Abspaltung der membranständigen Form des TNF entstehen kann. TNF-produzierende Zellen exprimieren oft auch TNF-Rezeptoren und zeigen TNF-Antworten. Inwieweit jedoch membranständiges TNF (tmTNF) an diesen autokrinen bzw. juxtakrinen Signalschleifen beteiligt ist, ist bisher unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß HeLa-Zellen, die eine nicht proteolytisch prozessierbare, mutante Form des TNF-Moleküls als membranständiges Molekül exprimieren (HeLatmTNF-Zellen), konstitutiv tmTNF-TNF-R1 Komplexe an der Zelloberfläche exprimieren. Diese Zellen zeigen eine kontinuierliche NF-kB- und p38 MAP Kinase-Aktivierung. Diese konstitutiv aktivierten Signalwege induzieren eine tmTNF-abhängige kontinuierliche Expression des NF-kB-abhängigen IL-6-Gens in diesen Zellen. HeLa-Zellen gehen nach einer kombinierten Behandlung von TNF mit Cycloheximid bzw. mit IFN-g in die Apoptose. HeLatmTNF-Zellen gingen bereits bei einer alleinigen Behand-lung mit Cycloheximid oder IFN-g in Apoptose. Daraus läßt sich schließen, daß HeLatmTNF-Zellen sich in einem kontinuierlichen Aktivierungszustand befinden, der bei Inhibition der Proteinbiosynthese ausreichend ist, um in den Zellen apoptotische Signalkaskaden zu aktivieren. Für diesen Signalweg war kein Zell-Zell-Kontakt notwendig. Es ist deshalb davon auszugehen, daß tmTNF über TNF-R1 auf der gleichen Zelle Signale weiterleiten kann und dadurch zu dem konstitutiv aktivierten Status der Zelle beiträgt. Die Daten weisen darauf hin, daß autotrope Signalschleifen von tmTNF über TNF-R1 existieren.Item Open Access Analyse eines Vielstrahl-Wellenleiters zur Übertragung hoher Mikrowellenleistungen(1999) Empacher, Lars; Schumacher, Uwe (Prof. Dr. rer. nat.)Analyse der optischen Eigenschaften eines Spiegelsystems, welches gleichzeitig die Übertragung mehrerer quasioptischer Strahlen erlaubt. Dieser Vielstrahl-Wellenleiter ist eine elegante Alternative zum konservativen Design aus vielen einzelnen Übertragungsleitungen, da Aufwand und Kosten erheblich reduziert sind bei sehr geringen Einbußen der Abbildungsqualität und unter Erhalt der vollen Breitbandigkeit einer quasioptischen Leitung. Der Wellenleiter wurde mit numerischen Methoden, experimentell und nicht zuletzt analytisch untersucht. Es fand sich jeweils eine sehr gute Übereinstimmung. Günstige optische Eigenschaften ergeben sich, wenn vier Spiegel gleicher Brennweite konfokal angeordnet werden, wobei sie entweder die Ecken eines Quadrates bilden oder in Zick-Zack-Anordnung stehen. Ein solches System wird eingesetzt werden in einer Anlage zur Elektron-Zyklotron-Resonanz-Heizung eines magnetisch eingeschlossenen Fusionsplasmas. Hier müssen zehn Millimeterwellenstrahlen mit 70-140GHz und Leistung im Megawattbereich über circa 50 Meter transmittiert werden. Außerdem wird ein Verfahren vorgestellt, mit dem ein beliebiges paraxiales Mikrowellenfeld mit Hilfe von zwei phasenkorrigierenden Spiegeln, hergestellt auf der Basis von Thermobildern, an die Übertragungsleitung angepasst, das heißt in einen gaußschen Strahl umgewandelt wurde.Item Open Access Die Lipase aus Rhizopus oryzae: Klonierung, Expression, Reinigung und Mutagenese eines industriell relevanten Enzyms für die Biokatalyse und die Strukturbestimmung(1999) Minning, Stefan; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Die Lipase aus Rhizopus oryzae (ROL) konnte in der Vergangenheit in E. coli erfolgreich in Form inaktiver Einschlußverbindungen exprimiert werden. Um daraus die aktive Lipase zu erhalten, musste diese durch eine teure und aufwendige Rückfaltungsprozedur renaturiert werden. Da die Hefe Pichia pastoris dafür bekannt ist, heterologe Proteine mit großen Ausbeuten zu exprimieren wurde sie zur Produktion der reifen ROL, sowie diverser Mutanten verwendet. Die Expression unter Kontrolle des methanol-induzierbaren Alkoholoxidase Promotors (AOX1) ergab wesentlich höhere Ausbeuten wie unter dem konstitutiv exprimierenden Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Promotor (GAP). Er stellte deshalb für weitere Arbeiten den Promotor der Wahl dar. Es folgten eine Reihe fermenatativer Studien in komplexem Vollmedium, wie auch in synthetischem Medium zur Erhöhung der Lipase Ausbeute. Dabei konnten sowohl der Sauerstoffeintrag, wie auch die Fütterungsrate als Schlüsselparameter bei der Ausbeute identifiziert werden. In einem optimierten Fermentationsprotokoll konnte die sechsfache Menge aktiver Lipase, verglichen mit Escherichia coli erreicht werden. Die Lipase aus den verschiedenen Kultivierungen in komplexem Medium konnte durch einen Konzentrierungs- und einen Chromatographieschritt bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Die ROL aus Pichia pastoris wurde biochemisch charakterisiert und die Eigenschaften mit denen der ROL aus Escherichia coli verglichen. Abgesehen von der erhöhten Thermostabilität der ROL aus P. pastoris verhielten sich die Enzyme aus beiden Expressionssystemen sehr ähnlich. Außerdem konnte eine Klasse von zufällig erzeugten Fusionspeptiden ausgehend von der Metallbindungsstelle der ATPase 439 von Helicobacter pylori zur Verwendung in der Metallafinitätschromatographie entwickelt werden. Durch High-Throughput Screening konnte ein Peptid identifiziert werden, welches gegenüber dem His-Tag verbesserte Eigenschaften aufwies.