Universität Stuttgart
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Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Interaction of carbon and nitrogen in iron(Stuttgart : Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme (ehemals Max-Planck-Institut für Metallforschung), 2016) Göhring, Holger; Mittemeijer, Eric Jan (Prof. Dr. Ir.)Item Open Access Spectroscopic investigations of the magnetic anisotropy of lanthanide- and cobalt-based molecular nanomagnets(2016) Rechkemmer, Yvonne; Slageren, Joris van (Prof. Dr.)Single-molecule magnets are metal complexes exhibiting an energy barrier for spin reversal, leading to magnetic bistability and slow relaxation of the magnetization. Their potential for practical applications such as high-density magnetic data storage was recognized early on and with the goal of achieving high energy barriers, different kinds of single-molecule magnets have been synthesized. The quadratic dependence of the barrier height on the spin motivated chemists to synthesize metal complexes with very high total spins; however, with limited success. It was shown that high spins come along with low anisotropies and increased interest thus focused on the synthesis and investigation of (mononuclear) complexes of highly anisotropic metal centers, e.g. lanthanide or cobalt complexes. Although rather high energy barriers can be achieved in such systems, practical application remains problematic and has not been realized yet. Reasons are for example the lack of rational design criteria and the complex interplay of different magnetic relaxation pathways. The aim of this work was therefore the comprehensive magnetic and spectroscopic investigation of selected molecular lanthanide and cobalt compounds in order to obtain a deeper insight into the correlation of molecular and electronic structures as well as the corresponding magnetic properties. The applied spectroscopic methods included electron paramagnetic resonance spectroscopy, far-infrared spectroscopy and optical methods. Special emphasis was placed on magnetic circular dichroism (MCD) spectroscopy, which served as a main tool for electronic structure determination. However, since the MCD-spectrometer was not part of the available experimental equipment at the University of Stuttgart, its design, setup and characterization were the first part of this work. In the further course of this work MCD-spectroscopy was employed for the electronic structure determination of selected lanthanide and cobalt compounds. The studied lanthanide compounds were literature-known molecular tetra-carbonates of erbium (1-Er) and dysprosium (1-Dy). Detailed magnetometric studies showed that both 1-Er and 1-Dy are field-induced single-molecule magnets; however, 1-Er and 1-Dy show significant differences in their magnetic relaxation behavior. The magnetic studies were complemented by detailed spectroscopic investigations.The combination of far-infrared-, luminescence- and MCD-spectroscopy allowed for the experimental determination of 48 energy levels for 1-Er and 55 levels for 1-Dy, which built the foundation for the subsequent crystal field analysis and electronic structure determination. In addition, the results of EPR-spectroscopic studies were used for fine-tuning and verifying the respectively determined crystal field parameters. Calculating the magnetic dipole strengths for transitions between the relevant states led to a quantitative understanding of the magnetic relaxation pathways. Besides the investigation of lanthanide compounds, this thesis deals with two classes of cobalt complexes. The first class comprises mononuclear complexes in which one Co(II) ion is ligated by the nitrogen donors of two doubly deprotonated 1,2-bis(methanesulfonamido)-benzene-ligands. Rather acute N-Co-N bite angles indicate strong deviations from ideal tetrahedral symmetry. The static magnetic properties hint at very high energy barriers for spin reversal and with the help of far-infrared spectroscopy, largely negative axial zero-field splitting parameters were determined. The corresponding energy barriers belong to the highest ever reported for 3d-transition metal complexes and investigating the dynamic magnetic properties confirmed single-molecule magnet behavior. The unique magnetic properties were fully explained by analyzing spectroscopic results. The MCD-spectra showed intense signals that were assigned to spin-allowed d-d-transitions. Subsequent crystal field analysis revealed that the strong axial crystal field generated by the ligands leads to a large splitting of the electronic terms and thus in turn to a relatively small energy gap between the electronic ground state and the first excited state. The resulting increase in second-order spin-orbit coupling explains the high energy barriers observed in the studied complexes. The second class of cobalt compounds studied in this work included dimers of distorted octahedrally coordinated Co(II) ions bridged by symmetrical or asymmetrical quinone based bridging ligands. The main focus of investigation lay on the impact of the bridging ligand on the magnetic coupling between the cobalt centers. Thus, the magnetic properties of the complexes were studied with the help of static susceptibility and magnetization measurements and analyzed by means of different models. Depending on the bridging ligand, different signs for the exchange coupling constants were found. The varying signs can be explained by different relative contributions of possible exchange paths, influenced by the different substituents at the bridging ligands or slight geometry differences. The observations indicate that electron withdrawing substituents favor ferromagnetic couplings, which are preferred in the context of molecular magnetism. All in all, it can be concluded that this work provides a contribution to the deeper understanding of the features relevant for single-molecule magnets. The electronic structure determination for selected lanthanide and cobalt complexes applying advanced magnetometric and spectroscopic techniques not only led to an understanding of the static and dynamic magnetic properties but also allowed for the development of design criteria and new approaches for improved single-molecule magnets in the future.Item Open Access Microstructural changes and intermetallic compound formation in metallic bilayers(Stuttgart : Max-Planck-Institut für Intelligente Systeme (ehemals Max-Planck-Institut für Metallforschung), 2016) Rossi, Paul J.; Mittemeijer, Eric Jan (Prof. Dr. Ir.)This thesis investigates interdiffusion and intermetallic compound (IMC) formation, as well as their effects on the microstructure, in metallic thin-film bilayers. The investigation focuses on bilayers based on the Ag-Sn and Ag-In binary systems, which are technologically important as basis for lead free solders. Due to the enhanced diffusional mechanisms in these systems, diffusion occurs readily even at room and low temperatures. The proceeding interdiffusion eventually leads to IMC formation in the bilayers, allowing for the investigation of the kinetics of IMC formation and the associated microstructural changes at room and low temperatures. The combination of the properties special to thin films with the diffusional mechanisms in the binary Ag-Sn and Ag-In systems leads to interesting effects, such as the dependence of IMC formation on the stacking sequence in the bilayers. The obtained experimental results for both systems could be explained using thermodynamic and kinetic models. Experimental characterization of the bilayers mainly relied on X-ray diffraction (XRD) and electron microscopy. In order to investigate the effect of the deposition process on IMC formation and the microstructure of the bilayers, different physical vapor deposition (PVD) techniques, especially thermal evaporation and magnetron sputtering, were used for the preparation of the bilayers. During investigation of the Ag-Sn system it was found that ambiguity exists among the published crystal structures of the Ag3Sn IMC. Therefore, the crystal structure of Ag3Sn has been reinvestigated using high-resolution XRD in connection with Rietveld refinements.Item Open Access Chiral metamaterials(2016) Eslami, Sahand; Fischer, Peer (Prof. Dr.)Item Open Access Biotechnologische Darstellung und strukturelle Charakterisierung fucosylierter Oligosaccharide(2016) Baumgärtner, Florian; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Die in Muttermilch mit bis zu 15 g l-1 enthaltenen humanen Milcholigosaccharide (HMOs) stellen eine bedeutende Gruppe bioaktiver Naturstoffe dar und zeigten in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten zahlreiche positive Effekte für die Entwicklung von Säuglingen. Mit über 200 beschriebenen und über 100 strukturell charakterisierten Oligosacchariden weisen HMOs dabei eine große Strukturvielfalt auf. Untersuchungen der physiologischen Effekte von HMOs wurden in der Vergangenheit neben wenigen isolierten oder synthetisierten Reinstoffen häufig mit HMO-Gemischen durchgeführt, welche aus humaner Milch isoliert wurden. Der Grund hierfür ist, dass chemische Synthesen wegen der benötigten Schutzgruppenchemie aufwändig sind und enzymatische Synthesen mit Leloir-Glycosyltransferasen bzw. Glycosidasen kostspielige Nukleotid-aktivierte Zucker als Substrate benötigen bzw. geringe Produktausbeuten zeigen. Durch die Kombination hoher Regio- und Stereoselektivitäten von Leloir-Glycosyltransferasen mit einer kostengünstigen Bereitstellung von Nukleotid-aktivierten Zuckern waren in der Vergangenheit Ganzzellsynthesen einiger HMOs unter Verwendung von Plasmid-basierten Expressionen rekombinanter Gene beschrieben worden. Um die Synthese weiterer HMOs mittels Ganzzellsynthesen zu ermöglichen und dabei auf die Verwendung von Selektions-Systemen für Plasmid-tragende Zellen verzichten zu können, wurden in dieser Arbeit Plasmid-freie Stämme zur Synthese verschiedener HMOs konstruiert und die damit synthetisierten Oligosaccharide isoliert sowie analysiert. Die Stammkonstruktion erfolgte dabei durch chromosomale Integration von Expressionskassetten in Zuckerdegradations-Loci mittels homologer Rekombination und Selektion auf die Ortsspezifität der Integration mittels pH-Indikator Agarplatten. Unter Verwendung verschiedener Glycosyltransferase-Gene aus Helicobacter pylori, Escherichia coli und Neisseria meningitidis in Escherichia coli-Zellen, welche Nukleotid-aktivierte Zucker bereitstellen und Lactose aufnehmen, konnten so unter anderem die HMOs 2‘-Fucosyllactose (2‘-FL), 3-Fucosyllactose (3-FL), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-fucopentaose I (LNFP I) und Lacto-N-difucohexaose II (LNDFH II) synthetisiert, isoliert und charakterisiert werden. Basierend auf den bereits vor dieser Arbeit am Institut für Mikrobiologie der Universität Stuttgart konstruierten E. coli Stämmen JM109 gwBC-F1 und JM109 gwBC F2-cat konnte eine Erhöhung der Produktivität von 2‘-FL durch die Erhöhung der chromosomal integrierten Kopien des Fucosyltransferase-Gens futC aufgezeigt werden. Außerdem konnte durch die zusätzliche Nutzung des Salvage Pathway für die Synthese von GDP-L-Fucose die Produktbildung weiter erhöht werden. Dabei wurden in Schüttelkolben-Kulturen mit Plasmid-freien Stämmen 2‘-FL-Titer von 1,06 ± 0,21 g l-1 bzw. 2,00 ± 0,04 g l-1 ohne bzw. mit Nutzung des Salvage Pathway erreicht. In einer darauffolgenden, Antibiotika-freien Zulaufkultivierung mit einem Endvolumen von 13,5 l und den Kohlenstoffquellen Glycerin und Lactose wurde ein 2‘-FL-Titer von 20,28 ± 0,83 g l-1 und somit etwa 270 g 2‘ FL mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,57 g l 1 h-1 produziert. In einem weiteren Teil dieser Arbeit konnte durch die Konstruktion des Stammes E. coli LJ-AYO-cat mit integrierten Genen einer Lactose-Permease, β1,3-N-Acetylglucosaminyl-transferase und β1,3-Galactosyltransferse erstmals die Synthese des HMO LNT in rekombinanten Mikroorganismen beschrieben werden. Dabei wurde unter Verwendung von Galactose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu Glycerin bzw. Glucose eine höhere intrazelluläre Konzentration des Donor-Substrats UDP-Galactose bestimmt, in Schüttelkolben 0,81 ± 0,01 g l-1 LNT synthetisiert und in einer Galactose-limitierten Zulaufkultivierung ein LNT-Titer von 12,72 ± 0,21 g l-1 erreicht. Bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,37 g l-1 h-1 wurden so 173 g des Tetrasaccharids LNT produziert. Durch die Ausstattung dieses LNT-synthetisierenden Stammes mit den Genen einer α1,2 bzw. α1,4-Fucosyltransferase und dem Salvage Pathway zur Synthese von GDP-L-Fucose wurden anschließend erstmalig rekombinante Ganzzellsynthesen fucosylierter Derivate von LNT beschrieben und dabei in Schüttelkolben-Kulturen 0,272 ± 0,006 g l-1 LNFP I bzw. 0,547 ± 0,004 g l-1 LNDFH II gebildet. Die Strukturen der gebildeten HMOs konnten nach der Isolierung jeweils mittles Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Somit konnten in dieser Arbeit die Ganzzellsynthesen verschiedener HMOs mit Plasmid-freien Stämmen dargestellt, die Titer und Raum-Zeit-Ausbeuten in der Synthese von 2‘ FL erhöht und die Auswahl der mittels Ganzzellsynthesen herstellbaren HMOs um Typ I-HMO-Strukturen erweitert werden.Item Open Access Development of culture media for the construction of vascularized adipose tissue and vascularized 3D full-skin equivalents in vitro(2016) Huber, Birgit; Tovar, Günter (Prof. Dr.)Item Open Access Metabolismus nicht-physiologischer Substrate in Mikroorganismen(2016) Reznicek, Ondrej; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Operational scenarios optimization for resupply of crew and cargo of an International gateway Station located near the Earth-Moon-Lagrangian point-2(2016) Lizy-Destrez, Stéphanie; Messerschmid, Ernst (Prof. Dr.)In the context of future human space exploration missions in the solar system (with an horizon of 2025) and according to the roadmap proposed by ISECG (International Space Exploration Coordination Group) [1], a new step could be to maintain as an outpost, at one of the libration points of the Earth-Moon system, a space station. This would ease access to far destinations as Moon, Mars and asteroids and would allow testing some innovative technologies, before employing them for far distant human missions. One of the main challenges will be to maintain permanently, and ensure on board crew health thanks to an autonomous space medical center docked to the proposed space station, as a Space haven. Then the main problem to solve is to manage the station servitude, during deployment (modules integration) and operational phase. Challenges lie, on a global point of view, in the design of the operational scenarios and, on a local point of view, in trajectories selection, so as to minimize velocity increments (energy consumption) and transportation duration (crew safety). Which recommendations could be found out as far as trajectories optimization is concerned, that would fulfill energy consumption, transportation duration and safety criterion? What would technological hurdles be to rise for the building of such Space haven? What would be performances to aim at for critical sub-systems? Expected results of this study could point out research and development perspectives for human spaceflight missions and above all, in transportation field for long lasting missions. Thus, the thesis project, presented here, aims starting from global system life-cycle decomposition, to identify by phase operational scenario and optimize resupply vehicle mission.Item Open Access Wasserinfiltration in die ungesättigte Zone eines makroporösen Hanges und deren Einfluss auf die Hangstabilität(Stuttgart : Eigenverlag des Instituts für Wasser- und Umweltsystemmodellierung der Universität Stuttgart, 2016) Germer, Kai; Bárdossy, András (Prof. Dr. rer. nat. Dr.-Ing.)Hangrutschungen stellen in besiedelten Regionen eine große Gefahr dar, weil nicht selten direkt bewohnte Bereiche betroffen sind. Aber auch die Rutschungsauswirkungen auf die Infrastruktur wie Verkehrswege und Versorgungseinrichtungen können der Gesellschaft Schaden zufügen. Zum einen ergibt sich im Zusammenhang mit Hangrutschungen und allgemein Massenbewegungen das Betätigungsfeld der direkten Stabilisierung und Verhinderung von Rutschungen durch beispielsweise Tiefdrainagen und aufwendige ingenieursbauliche Maßnahmen. Zum anderen, und das ist Gegenstand dieser Arbeit, ergibt sich das Tätigkeitsfeld der grundlagenorientierten Forschung, um die Prozesse, die zu Hangrutschungen führen, besser verstehen zu können. Mit dem Heumöser Hang in Österreich (Vorarlberg), einem sich sehr langsam bewegenden Großhang (Kriechhang), liegt ein Untersuchungsobjekt vor, an dem vielfältige hydrologische Prozesse stattfinden, die schon über mehrere Jahre hinweg untersucht wurden. Die Untersuchungen resultierten in der Hypothese, dass sich am Heumöser Hang entwickelnder Makroporenfluss zu schnellen hydraulischen Veränderungen im Innern des Hangkörpers führe. Die hydraulischen Veränderungen zeigen sich insbesondere in starken Porenwasserdruckanstiegen (unter anderem in einem gespannten Grundwasserleiter), die teilweise in der Tiefe des Hanges zu Auftriebskräften führen, die den Hang destabilisieren, so dass dieser sich schubweise insgesamt etwa ein bis zwei Dezimeter im Jahr talwärts bewegt. Zum Erarbeiten des Prozessverständnisses bezüglich des Zusammenhanges zwischen Infiltration und Hangstabilität wurden große Bodenproben vom Hang im Labor untersucht und Experimente an zwei technischen Modellen durchgeführt. Mit der vorgestellten Vorgehensweise und der Separierung der Untersuchungen und Experimente konnten für den Heumöser Hang relevante hydrologische und mechanische Teilaspekte erarbeitet werden, die verknüpft die Hangbewegungshypothese in weiten Teilen bestätigen können. Insbesondere bestätigten die Messungen an den originären Bodenproben vom Heumöser Hang, dass der Makroporenfluss so dominant sein kann, dass potentiell schneller Porenwasserdruckanstieg in der Tiefe erzeugt werden kann. Dennoch kann ein Makroporenfluss generell insbesondere bei trockenen Matrixbedingungen vermindert werden. Die Verminderung des Makroporenflusses wurde anhand von Experimenten mit Sand gezeigt. Der Prozess des Wassertransfers von Makropore zu umgebender Matrix ist im Sand sehr deutlich zu sehen. Darüber hinaus konnten bei Bodensäulen- und Bodenprobenexperimenten viele methodische Herangehensweisen getestet und verglichen werden. Weil im Vorfeld der Untersuchungen schon abgeschätzt wurde, dass nur mit größeren Proben eine für den Standort bessere Repräsentativität der Ergebnisse erhalten werden kann, wurde besonders viel Wert auf die Methodik der Großprobennahme gelegt. So ist in der vorgestellten Arbeit ein neuartiger Ansatz zur Großprobennahme entwickelt worden, bei dem die Proben ungestört frei gelegt wurden und mit Haushaltsfolie, Montageschaum und Außenmodulen eingehüllt wurden. Nur die Großprobennahme garantierte ein Mindestmaß an Erfassung von Heterogenitäten und Bodenstrukturen im Dezimeterbereich, wie z.B. Makroporen und Risse. Auch die laboratorischen Versuchsaufbauten zur Anwendung der Multi-Step-Outflow- und Evaporationsmethode an den Großproben wurden einmalig größenangepasst entwickelt.
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