Universität Stuttgart
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Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Subzelluläre Metabolit-Analyse in Säugerzellen : Methodenentwicklung und Anwendung zur Untersuchung des Stoffwechsels von CHO-Zellen(2017) Matuszczyk, Jens-Christoph; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Biotechnologische Darstellung und strukturelle Charakterisierung fucosylierter Oligosaccharide(2016) Baumgärtner, Florian; Sprenger, Georg A. (Prof. Dr.)Die in Muttermilch mit bis zu 15 g l-1 enthaltenen humanen Milcholigosaccharide (HMOs) stellen eine bedeutende Gruppe bioaktiver Naturstoffe dar und zeigten in verschiedenen wissenschaftlichen Arbeiten zahlreiche positive Effekte für die Entwicklung von Säuglingen. Mit über 200 beschriebenen und über 100 strukturell charakterisierten Oligosacchariden weisen HMOs dabei eine große Strukturvielfalt auf. Untersuchungen der physiologischen Effekte von HMOs wurden in der Vergangenheit neben wenigen isolierten oder synthetisierten Reinstoffen häufig mit HMO-Gemischen durchgeführt, welche aus humaner Milch isoliert wurden. Der Grund hierfür ist, dass chemische Synthesen wegen der benötigten Schutzgruppenchemie aufwändig sind und enzymatische Synthesen mit Leloir-Glycosyltransferasen bzw. Glycosidasen kostspielige Nukleotid-aktivierte Zucker als Substrate benötigen bzw. geringe Produktausbeuten zeigen. Durch die Kombination hoher Regio- und Stereoselektivitäten von Leloir-Glycosyltransferasen mit einer kostengünstigen Bereitstellung von Nukleotid-aktivierten Zuckern waren in der Vergangenheit Ganzzellsynthesen einiger HMOs unter Verwendung von Plasmid-basierten Expressionen rekombinanter Gene beschrieben worden. Um die Synthese weiterer HMOs mittels Ganzzellsynthesen zu ermöglichen und dabei auf die Verwendung von Selektions-Systemen für Plasmid-tragende Zellen verzichten zu können, wurden in dieser Arbeit Plasmid-freie Stämme zur Synthese verschiedener HMOs konstruiert und die damit synthetisierten Oligosaccharide isoliert sowie analysiert. Die Stammkonstruktion erfolgte dabei durch chromosomale Integration von Expressionskassetten in Zuckerdegradations-Loci mittels homologer Rekombination und Selektion auf die Ortsspezifität der Integration mittels pH-Indikator Agarplatten. Unter Verwendung verschiedener Glycosyltransferase-Gene aus Helicobacter pylori, Escherichia coli und Neisseria meningitidis in Escherichia coli-Zellen, welche Nukleotid-aktivierte Zucker bereitstellen und Lactose aufnehmen, konnten so unter anderem die HMOs 2‘-Fucosyllactose (2‘-FL), 3-Fucosyllactose (3-FL), Lacto-N-tetraose (LNT), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-fucopentaose I (LNFP I) und Lacto-N-difucohexaose II (LNDFH II) synthetisiert, isoliert und charakterisiert werden. Basierend auf den bereits vor dieser Arbeit am Institut für Mikrobiologie der Universität Stuttgart konstruierten E. coli Stämmen JM109 gwBC-F1 und JM109 gwBC F2-cat konnte eine Erhöhung der Produktivität von 2‘-FL durch die Erhöhung der chromosomal integrierten Kopien des Fucosyltransferase-Gens futC aufgezeigt werden. Außerdem konnte durch die zusätzliche Nutzung des Salvage Pathway für die Synthese von GDP-L-Fucose die Produktbildung weiter erhöht werden. Dabei wurden in Schüttelkolben-Kulturen mit Plasmid-freien Stämmen 2‘-FL-Titer von 1,06 ± 0,21 g l-1 bzw. 2,00 ± 0,04 g l-1 ohne bzw. mit Nutzung des Salvage Pathway erreicht. In einer darauffolgenden, Antibiotika-freien Zulaufkultivierung mit einem Endvolumen von 13,5 l und den Kohlenstoffquellen Glycerin und Lactose wurde ein 2‘-FL-Titer von 20,28 ± 0,83 g l-1 und somit etwa 270 g 2‘ FL mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,57 g l 1 h-1 produziert. In einem weiteren Teil dieser Arbeit konnte durch die Konstruktion des Stammes E. coli LJ-AYO-cat mit integrierten Genen einer Lactose-Permease, β1,3-N-Acetylglucosaminyl-transferase und β1,3-Galactosyltransferse erstmals die Synthese des HMO LNT in rekombinanten Mikroorganismen beschrieben werden. Dabei wurde unter Verwendung von Galactose als Kohlenstoffquelle im Vergleich zu Glycerin bzw. Glucose eine höhere intrazelluläre Konzentration des Donor-Substrats UDP-Galactose bestimmt, in Schüttelkolben 0,81 ± 0,01 g l-1 LNT synthetisiert und in einer Galactose-limitierten Zulaufkultivierung ein LNT-Titer von 12,72 ± 0,21 g l-1 erreicht. Bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,37 g l-1 h-1 wurden so 173 g des Tetrasaccharids LNT produziert. Durch die Ausstattung dieses LNT-synthetisierenden Stammes mit den Genen einer α1,2 bzw. α1,4-Fucosyltransferase und dem Salvage Pathway zur Synthese von GDP-L-Fucose wurden anschließend erstmalig rekombinante Ganzzellsynthesen fucosylierter Derivate von LNT beschrieben und dabei in Schüttelkolben-Kulturen 0,272 ± 0,006 g l-1 LNFP I bzw. 0,547 ± 0,004 g l-1 LNDFH II gebildet. Die Strukturen der gebildeten HMOs konnten nach der Isolierung jeweils mittles Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Somit konnten in dieser Arbeit die Ganzzellsynthesen verschiedener HMOs mit Plasmid-freien Stämmen dargestellt, die Titer und Raum-Zeit-Ausbeuten in der Synthese von 2‘ FL erhöht und die Auswahl der mittels Ganzzellsynthesen herstellbaren HMOs um Typ I-HMO-Strukturen erweitert werden.Item Open Access Development of culture media for the construction of vascularized adipose tissue and vascularized 3D full-skin equivalents in vitro(2016) Huber, Birgit; Tovar, Günter (Prof. Dr.)Item Open Access Metabolismus nicht-physiologischer Substrate in Mikroorganismen(2016) Reznicek, Ondrej; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Die Wirkungen von akutem Stress auf Erlernen und Abruf erlernter Handlungs-Ergebnis-Beziehungen(2017) Braun, Stephanie; Hauber, Wolfgang (apl. Prof. Dr.)Stress hat umfangreiche Wirkungen auf die Art und Weise wie Menschen und Tiere lernen. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, wie sich akuter Stress, d.h. die kurzzeitige Einwirkung von Stress, auf das Handlungs-Lernen bei Ratten auswirkt. Die erhobenen Daten haben gezeigt, dass Ratten ähnlich wie Menschen reagieren, nämlich indem ihre Handlungen infolge von Stress nicht mehr zielgerichtet, d.h. flexibel, sondern automatisiert, d.h. unflexibel, ausgeführt werden.Item Open Access Modelling biogeochemical and mass transport processes in the subsurface: investigation of microbially induced calcite precipitation(Stuttgart : Eigenverlag des Instituts für Wasser- und Umweltsystemmodellierung der Universität Stuttgart, 2016) Hommel, Johannes; Class, Holger (apl. Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Naphthalen Dioxygenase aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 : systematische Analyse der aktiven Tasche(2017) Halder, Julia M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Die gezielte Oxyfunktionalisierung von Olefinen gehört zu den am meist gesuchten Reaktionen in der Chemie. Insbesondere die Dihydroxylierung und die daraus resultierenden chiralen, vicinalen 1,2-Diole spielen hierbei eine wichtige Rolle. So werden 1,2-Diole sowohl als chirale Liganden und Auxiliare und als chirale Synthons für Pharmabausteine sowie Agrochemikalien eingesetzt. Eine schnelle und effiziente Möglichkeit für die stereoselektive, asymmetrische Sharpless Dihydroxylierung (AD) von C=C-Doppelbindungen ergibt sich aus der Metall-katalysierten Oxyfunktionalisierung mittels Osmium oder anderen Übergangsmetallen. Neben der guten Ausbeute und der hohen Selektivität, stellen jedoch vor allem die Toxizität der Katalysatoren, sowie auch die Überoxidation und Spaltung der generierten cis-Diole Herausforderungen in der Anwendung dar. Rieske Nicht-Häm Dioxygenasen (ROs) sind eine biologische Alternative zur rein chemischen, asymmetrischen Dihydroxylierung. In der Natur sind diese Multikomponentensysteme, bestehend aus einer hexameren Oxygenase, einem Elektronen-Shuttlemolekül und einer Reduktase, für die Dihydroxylierung von aromatischen Motiven verantwortlich und katalysieren den ersten Schritt im Katabolismus von Aromaten. Mit der Entdeckung dieser effizienten Bio-katalysatoren wurde eine umweltfreundliche Alternative zur chemisch katalysierten Sharpless AD entdeckt. Aufgrund der Verfügbarkeit von Kristallstrukturen wurde die Naphthalen Dioxygenase (NDO) aus Pseudomonas sp. NCIB 9816-4 als ein Vertreter der ROs für das semi-rationale Design ausgewählt und Varianten im aktiven Zentrum des Enzyms generiert. Neben der direkten Katalyse am aromatischen Ring, wurde durch Variation der Substituenten auch die allylische Mono- bzw. die cis-Dihydroxylierung von Alkenylresten in aromatischen Molekülen (z. B. α-Methylstyrol, Allylbenzol) und die Katalyse von C=C-Doppelbindungen in nicht-aromatischen, nicht-planaren Molekülen (z. B. R-Limonen) gezeigt. Aufgrund der Vielfältigkeit dieser Enzyme besteht ein gesteigertes Interesse am biotechnologischen Einsatz, um das enorme Potential und die Vielfältigkeit des biokatalytischen Repertoires dieser Katalysatoren ausschöpfen zu können. Des Weiteren erfolgte die nähere Betrachtung der heterologen Herstellung des Biokatalystors in Escherichia coli, wobei sowohl in vitro als auch in vivo Systeme betrachtet wurden. Hierbei stand im Fall der in vitro Untersuchungen das Zusammenspiel der unterschiedlichen Komponenten des Systems, das Reaktionssetup und der Einfluss des Cosolvents im Mittelpunkt. Für das optimierte in vitro System wurden schließlich folgende Parameter definiert: (I) Verhältnis der Komponenten mit 1 μM Oxygenase, 20 μM Ferredoxin und 5 μM Reduktase, (II) das Reaktionssetup mit 2 mM Substrat in Ethanol bei 30 °C für 2 h, und (III) der Anteil des Cosolvents Ethanol mit 5 %(v/v). Ein Alanin-Scan der zwölf first shell Aminosäuren lieferte im in vitro System bereits erste Indizien für relevante Mutagenese-Hotspots mit den Positionen A206, H295, L307, G204 und V260. Im Gegensatz zum in vivo System wurde im in vitro System eine deutlich erniedrigte Aktivität gegenüber den untersuchten substituierten Aromaten detektiert, weshalb auf eine mangelnde Stabilität der Komponenten im in vitro System geschlossen wurde. Im in vivo System wurde zunächst die Optimierung der Expression forciert, wobei das entwickelte Expressions- und Biotransformationsprotokoll zu einer guten Reproduzierbarkeit in Ganzzellansätzen mit Standardabweichungen von unter 5 % geführt hat. Hierzu wurden frisch transformierte Zellen zur Anzucht (37 °C) in TB-Medium verwendet und bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,6-0,8 mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach 20-stündiger Expression bei 25 °C wurden eine Zellsuspension mit 0,1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) und 20 mM Glucose (0,2 gBFM/mL) für Ganzzellumsätze hergestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe des in Ethanol gelösten Substrates gestartet und nach 20 h bei 30 °C mit der Zugabe von Lösungsmittel gestoppt. Für die in vivo Untersuchung wurde ein semi-rationaler Mutageneseansatz gewählt, indem alle first shell Aminosäuren mit Alanin, Valin und Isoleucin (36 Varianten) ausgetauscht, sowie 25 Doppelvarianten an den Positionen A206, H295 und V260 generiert wurden. Mit dieser Bibliothek erfolgte die Identifizierung von wichtigen Struktur-Funktionsbeziehungen anhand von unterschiedlich substituierten Styrolderivaten und dem Monoterpen R-Limonen. Mit dem Einbringen einer Punktmutation in der aktiven Tasche konnten deutliche Veränderungen in der Reaktions- und Substratspezifität sowie in der Regio- und Stereoselektivität (≥ 90 %) beobachtet werden, wobei die Restaktivität gegenüber dem natürlichen Substrat Naphthalen (bis > 99 %) erhalten blieb. So stellten sich die Position A206, sowie die gegenüberliegenden Positionen H295, F202, F352, V260 und L307 in der planaren, zylinderförmigen aktiven Tasche als maßgeblich für die Steuerung der Aktivität und Selektivität der NDO dar. Generell konnte eine Abnahme der Aktivität mit steigender Substituentengröße und Verzweigungsgrad (Methyl- bis Pentyl- bzw. tert-Butyl-Reste) detektiert werden. Gleichfalls konnte eine Tendenz für ungesättigte Substituenten am Aromaten beobachtet werden, wobei die Aktivität von mono- über gem-di- und trans-di-substituierte Seitenketten abnahm. Bei der Untersuchung von unterschiedlichen Methoxystyrolderivaten konnte eine gesteigerte Spezifität und Stereoselektivität (≥ 95 %ee) beobachtet werden. Neben Hydroxylierungsreaktionen wurden hierbei auch Dealkylierungsreaktionen beobachtet. Die Dihydroxylierung wurde beim Vorliegen einer zum Aromaten konjugierten C=C-Doppelbindung gegenüber der O-Demethylierung bevorzugt. Lag die C=C-Doppelbindung isoliert zum aromatischen System vor, wurde hingegen eine Präferenz für die O-Demethylierung beobachtet. Grundsätzlich hat sich die NDO als einen guten Startpunkt für die biokatalysierte, asymmetrische Dihydroxylierung erwiesen und durch die systematische Analyse der aktiven Tasche konnten essentielle Stellschrauben für die weitere Verbesserung des Katalysator identifiziert werden.Item Open Access Electronic transport properties of DNA sensing nanopores : insight from quantum mechanical simulations(2017) Sivaraman, Ganesh; Fyta, Maria (Jun.-Prof. Dr.)The translocation of DNA through nanopores is an intensively studied field as it can lead to a new perspective in DNA sequencing. During this process the DNA is electrophoretically driven through a nanoscale hole in a membrane, and use different sensing schemes to read out the sequence. Within the scope of nanopore sequencing two important sensing schemes relevant to this thesis are: 1.) Tunneling sequencers based on solid state nanopores embedded with gold electrodes 2.) 2D materials beyond graphene For scheme 1, an obvious improvement is to coat the gold electrode with molecules that have high conductance and can form instantaneous hydrogen bond bridges with the translocating polynucleotide thereby improving the transverse current signal. The molecule that we propose is the so called diamondoid which are diamond caged molecules with hydrogen termination. Before applying such a molecule to a nanopore electrode set up, one would like to understand their interaction with DNA and its nucleobases. For this purpose, hydrogen bonded complexes formed between nitrogen doped derivatives of smallest diamondoids (i.e. adamantane derivatives) and nucleobases were investigated using dispersion corrected density functional theory (DFT). Mutated and methylated nucleobases are also taken into consideration in these investigations. DFT calculations revealed that hydrogen bonds are of moderate strength. In addition, starting from the DFT predicted hydrogen bonding configuration for each complex, rotations, and translations along a reference axis was performed to capture variations in the interaction energies along the donor-acceptor groups of the hydrogen bonds. The electronic density of states analysis for the hydrogen bonded complexes revealed distinguishable signatures for each nucleobase, thereby showing the suitability for application in electrodes functionalised with such probe molecules. In the next step, an adamantane derivative is placed on one of the electrode and nucleotides are introduced in such a way that nucleobases form hydrogen bonds with the of the nitrogen group of the adamantane derivatives. Electronic transport calculations were performed for gold electrodes functionalised with 3 different adamantane derivatives. Four pristine nucleotides, one mutated, and one methylated nucleotides were considered. Analysis of the transmission spectra reveal that each of the nucleotides has a unique resonance peak far below the Fermi level. We have also proposed a gating voltage window to sample the resonance peaks of the nucleotide so that they can be distinguished from each other. An alternative to tunneling sequencers would be to use nanopores built in to ultra thin metallic nanoribbons such as graphene. The sequence can be read out from the in-plane current modulation resulting from the local field effect of the translocating nucleotides in the vicinity of the metallic pore edges. But the hydrophobicity of graphene makes it a difficult candidate in aqueous environment. Hence in scheme 2, the aim is to model an ultra thin material that can rectify the hydrophobicity of graphene and can be a very good candidate for current modulation sequencing. Ultra thin MoS2 (2H) monolayer exist as direct band gap semiconductor. Nanopores based on 2H phases have been reported in the literature and are not hydrophobic. By means of chemical exfoliation of the 2H phase, a meta stable 1T phase of MoS2 has also been synthesized by various experimental groups. The 1T phase of MoS2 is metallic. The aim of this thesis is to model a nano-biosensor template based on a hybrid MoS2 monolayer made up of a metallic (1T) phase sandwiched between semiconducting (2H) phase. The sensor that we propose, should have only metallic nanopore edges. As a first step, we have modeled the semiconductor-metal interface, and compared them with experiments. Then an investigation to understand the influence of the increase of the metallic unit on the electronic properties is performed. Since, point defects are highly relevant to electrochemical pore growth, a point sulfur defect analysis is provided to ascertain the weakest point in the sheet. Finally to understand the effect of the interface electronic transport calculations are performed. The transmission spectra reveals a clear asymmetry in the current flow across the interface by means of gating. In the end, the relevance of such a hybrid MoS2 material for nanopore sequencing is discussed.Item Open Access Characterization and application of novel imine reductases(2016) Scheller, Philipp; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Chiral amines are an ubiquitously distributed class of bioactive compounds, what turns them into preferred scaffolds for pharmaceuticals. The high chemical and enantiomerical purities required for such an application are ideally suited for biocatalysis as enzymatic methods routinely display high specificities. The established methods for chiral amine synthesis with lipases, ω-transaminases and amine oxidases, however have considerable limitations regarding their access to pharmaceutically relevant chiral secondary and tertiary amines. Recently the new enzyme class of imine reductases (IREDs) was described, offering an attractive extension to the currently used techniques as the preparation of imines by chemical methods in organic solvents is a well established and widely applicable method. As the number of IREDs known initially was limited to only three enzymes, this project started with a database search for the discovery of novel enzymes. For the first time it was shown that the IRED family is much larger than assumed and over 350 novel, putative IREDs were identified. A sequence analysis of the database members revealed (R)- type and (S)- type superfamilies and led after an update to the identification of IRED specific sequence motifs. These criteria allowed to define this new enzyme family on a sequence level and discriminate them from the closest related homologues. Based on the biochemical information about the three published IREDs and a conservation analysis of the database members, three new enzymes from Streptosporangium roseum DSM43021, Streptomyces turgidiscabies and Paenibacillus elgii were selected for characterization. The enzymes were shown to encode for functional IREDs with much higher activity than the previously known IREDs. By site directed mutagenesis the mechanism of the IREDs was probed and the importance of a conserved Tyr for catalysis of an (S)- type IRED shown, while the crucial role of the proposed Asp residue for catalysis in the (R)- type IREDs was questioned. The characterization of the new IREDs revealed their pH optima and confirmed the suspected dimerization. The thermostability of the IREDs was investigated and the selected (S)- type IRED identified as the most stable enzyme known to date. Further the activity in the presence of water miscible organic solvents was tested and high tolerance versus MeOH found. In biotransformations all IREDs showed high activity and a broad panel of cyclic imines was fully converted to piperidines and tetrahydroisoquinolines with enantioselectivities up to 99% ee. With purified IREDs kinetic constants for these substrates were recorded and their substrate preference investigated. This indicated a preference of the (S)- type IRED for more bulky substrates, compared to the (R)- type IREDs. After optimization of the reaction conditions, with purified IREDs also high activities and chemo- as well as enantioselectivities for very labile exocyclic imines were detected. The possibility to effectively reduce already low levels of such imines led to the application of one (R)- type IRED for the generation of novel C-N bonds by reductive aminations. The established methodology revealed the crucial influence, conditions that favor imine formation (high molar excess of the amine nucleophile and high pH) display on the conversion rates. Under optimized conditions, different carbonyls could efficiently be transformed with a variety of amines in the aqueous buffer system with moderate to good conversions into primary and secondary (chiral) amines with very high selectivities (ee up to 98%). Finally, an application of IREDs in cascade reactions to produce saturated N-heterocyclic compounds was envisioned. A microbial putrescine oxidase (PuO) was chosen to selectively oxidize polyamines to aminoaldehydes, thereby triggering their spontaneous cyclization to an imine. To target a broad range of heterocycles, PuO was characterized with a range of unnatural polyamines. The results indicated a narrow substrate scope and low activity for these compounds. To enhance the activity for such substrates directed evolution of PuO with epPCR was performed and led to the identification of a Glu residue, representing a hotspot for mutagenesis. This residue aligns to one of the multiple channels that lead into the deeply buried active site of PuO and it is located in the second shell around the active site. By site-saturation mutagenesis further mutants in the active site and this channel were generated and many mutants with smaller amino acids demonstrated the influence of this hotspot position to increase the activity of the enzyme. The best mutant exhibited considerably increased activities (up to 25-fold) for unnatural polyamines and also for natural polyamines the substrate spectrum was strongly shifted from putrescine towards longer polyamines like spermidine which is now transformed with a 10-fold increased catalytic efficiency (kcat/KM). The combination of both enzymes in purified form as well as in whole cells enabled the production of heterocyclic amines relying on the consecutive transformation of the substrate by both enzymes. While with the whole cell system only low amounts of the N-heterocyclic compounds were produced, the utilization of purified enzymes led in case of all three IREDs to high conversions of different polyamines into pyrrolines and piperidines.