Universität Stuttgart
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Item Open Access In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Bedeutung des intestinalen Arzneimittelmetabolismus und -transportes beim Menschen(2003) Gläser, Hartmut; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)Mit dem Nachweis von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (AME) und Arzneimitteltransportern im Dünndarm des Menschen wurde die Bedeutung des intestinalen Metabolismus für die Bioverfügbarkeit oral applizierter Arzneimittel zunehmend erkannt. Die mangelnde Verfügbarkeit von humanen Enterozyten stellt bei Untersuchungen zum intestinalen Arzneimittelmetabolismus und -transport ein wesentliches Problem dar. Zur Expression und ex vivo Funktion von Cytochrom P450 Enzyme sowie deren Modifikation durch Rifampicin in humanen Enterozyten existieren keine systematischen Daten. Auch sind die Kenntnisse über die Expression und in vivo Funktion von intestinalen Arzneimitteltransportern und deren Beeinflussung durch Rifampicin sehr gering. Mit einem multiluminalen Perfusionskatheter (MLPC) zur Gewinnung von humanen Enterozyten und einer Gewebesammlung von Dünndarm- und Leberproben von jeweils demselben Patienten wurde versucht, die o.g. Probleme zu bearbeiten. Die Charakterisierung der mit dem MLPC gewonnenen Zellen zeigte, dass vitale, abgeschilferte Enterozyten gewonnen, und sowohl zur Untersuchung der Expression von AMEs und Transporter als auch zur ex vivo Analyse des intestinalen Metabolismus verwendet werden können. Unter Einsatz des MLPCs wurde in einer Studie die Induktion von CYP2C8, 2C9 und 3A4 durch Rifampicin in den Enterozyten nachgewiesen. Mit Hilfe des MLPCs konnte auch die Funktion und Expression des Arzneimitteltransporters P-Glykoprotein (Pgp) untersucht werden. Für die funktionelle in vivo Analyse wurde Chinidin bei gleichzeitiger i.v. Gabe des Pgp-Substrates Digoxin luminal über den MLPC verabreicht. Damit konnte die Bedeutung des intestinal exprimierten Pgp sowohl für die systemische Elimination von Digoxin als auch für die Resorption von Chinidin nachgewiesen werden. Zudem konnte die Zunahme der Elimination von Digoxin bzw. Abnahme der Chinidinresorption nach Gabe von Rifampicin gezeigt werden. Die Expressionsanalyse von MRP2 in Dünndarm und Leber zeigte keinen Unterschied im Ausmaß der Expression in den beiden Geweben. Die Tatsache, dass im Dünndarm - nicht aber in der Leber - eine Korrelation zwischen MRP2 mRNA und Protein nachgewiesen wurde, gibt einen Hinweis auf unterschiedliche Regulationsmechanismen von MRP2 in den beiden Geweben.Item Open Access Verknüpfung molekularphysiologischer und reaktionskinetischer Werkzeuge zum Studium der in vivo Regulation des Glukosetransports von Saccharomyces cerevisiae(2003) Buziol, Stefan; Reuss, Matthias (Prof. Dr.-Ing.)In der vorliegenden Arbeit wurde der Glukosetransport von Saccharomyces cerevsisiae auf reaktionskinetischer und molekularphysiologischer Ebene untersucht. Der Transport von Hexosen beruht bei S. cerevisiae auf dem Prozess der carriervermittelten erleichterten Diffusion. Durch die Expression geeigneter Transportproteine aus einem Set von 20 Genen kann sich die Zelle auf die Umgebungsbedingungen einstellen. Zunächst wurden die kinetischen Parameter für die Transportproteine Hxt1, Hxt5 und Hxt7 anhand von Einzelexpressionsmutanten in vivo geschätzt. Zusätzlich wurde der Wildtyp charakterisiert. Durch den Einsatz der aeroben fed-batch Kultivierung wurde der quasi-stationäre Zustand, der die Grundvoraussetzung für diese Untersuchungen ist, im Gegensatz zum steady-state bei Chemostat-Kultivierung nach kürzerer Zeit erreicht. Ausgehend von Zellpopulationen unter physiologisch definiertem Zustand wurden Glukosepulsversuche durchgeführt, und die Abnahme der extrazellulären Glukose verfolgt. Dieses Signal wurde mit dem Resultat einer numerischen Integration der dynamischen Bilanzgleichung verglichen, um unter Verwendung einer irreversiblen Michaelis-Menten Kinetik die kinetischen Parameter für die Einzelexpressionsmutanten und den Wildtyp abzuschätzen. Um den Transportschritt vollständig beschreiben zu können, ist es nötig, die Konzentrationen von intrazellulärer Glukose und Glukose-6-Phosphat (G6P) miteinzubeziehen. Es ist hierbei von Bedeutung, die initiale Aufnahmerate zu erfassen, da es während der Glukoseaufnahmemessungen zu einem Anstau intrazellulärer Glukose und infolgedessen einem Efflux derselben kommen kann. Dieser Efflux überlagert dann die Aufnahmemessungen. Während für die Messung von G6P geeignete Zellaufschluss und Extraktionsverfahren zur Verfügung standen, musste zur Erfassung des Signals intrazellulärer Glukose eine neue Methode entwickelt werden. Durch die Etablierung einer stopped-flow Probenahmetechnik wurde es möglich, die Dynamik der Konzentrationen intrazellulärer Glukose und von G6P im Millisekundenbereich zu erfassen. Die experimentellen Daten für die Dynamik von intrazellulärer Glukose und G6P können nun eingesetzt werden um ein Modell des Glukosetransports zu validieren, das auf einer reversiblen Influx-Efflux Kinetik basiert und eine Inhibition durch G6P berücksichtigt. In weiteren Untersuchungen wurde durch den Einsatz von Western blot Analysen die Dynamik der Hexosetransportproteine (Hxt1, Hxt5 und Hxt7) parallel als Antwort auf Veränderungen in der Glukosekonzentration verfolgt. Die gemessenen Konzentrationen für extrazelluläre Gukose, Ethanol und Biomasse wurden mittels Western blot Analyse mit der Expression der Transportproteine korreliert. Zuerst wurde eine glukoselimitierte Chemostat-Kultivierung auf einen batch-Prozess unter Glukoseüberschuss umgeschaltet. Dabei wurde eine Reprimierung des intermediäraffinen Hxt5-Proteins und eine Induktion von Hxt1, dem niedrigaffinen Transporter beobachtet. Die Expression des hochaffinen Hxt7-Transporters wird nach dem Umschalten zunächst verstärkt, um dann stark abzunehmen. Dies könnte einen Mechanismus der Zelle darstellen, auf die erhöhten Glukosekonzentrationen schnell zu reagieren. Beim zweiten Ansatz wurde eine Chemostat-Kultur durch multiple Glukosepulse dynamisch angeregt. Es konnte kein Einfluss der multiplen Stimuli auf die Expression der Transporter Hxt1 und Hxt5 nachgewiesen werden. Hxt7 hingegen zeigte deutliche Änderungen im Expressionsprofil. Es wurde eine Korrelation zwischen der Expression von Hxt7 und den spezifischen Raten für die Glukoseaufnahme und die Ethanolbildung beobachtet. Die Anwendung des Konzepts der "Metabolic control analysis" (Sensitivitätsanalyse) auf ein dynamisches Modell zur Beschreibung des anaeroben Wachstums von S. cerevisiae zeigte, dass die überwiegende Kontrolle des glycolytischen Flusses auf dem Transportschritt liegt. Somit sollte eine Erhöhung der Transportkapazität zu einem höheren glycolytischen Fluss führen. Unter Verwendung einer HXT5-Überexpressionsmutante (HXT5-Multicopyplasmid), der HXT5-Einzelexpressionsmutante sowie des Wildtyps wurden vergleichende Messungen des glycolytischen Flusses durchgeführt. Dazu wurden anaerobe Chemostat-Kulturen eingesetzt und die spezifischen Glukoseaufnahme- und Ethanolbildungsraten gemessen. Die Erhöhung der spezifischen Raten war unbefriedigend. Dies könnte an der durch die Überexpression verursachten "protein burden" liegen oder das Resultat von stark veränderten Poolkonzentrationen sein. Somit sollte ein zukünftiger Ansatz zur Steigerung der glycolytischen Leistung die Minimierung des "protein burden" sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase berücksichtigen. Wie sich aus weiteren Simulationsergebnissen ergab, müssen dabei auch Enzyme berücksichtigt werden, die der Erhöhung der Poolkonzentrationen entgegenwirken.Item Open Access Herstellung von 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat aus Toluol : Konstruktion von Stämmen für die selektive Hydroxylierung(2003) Gittinger, Simone; Knackmuss, Hans-Joachim (Prof. Dr.)Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein biotechnisches Verfahren zur selektiven Hydroxylierung von Kohlenwasserstoffen zu entwickeln. Als Beispiel für einen derartigen Prozess sollte die Herstellung von Phenol aus Toluol ermöglicht werden. Für die Produktion von Phenol aus Toluol ist ein zweistufiges Verfahren notwendig: Die Biotransformation von Toluol zu Benzoatdihydrodiol (cis-Cyclohexa-3,5-dien-1,2-diol-1-carboxylat oder 1,2-Dihydro-1,2-dihydroxybenzoat) und die anschließende mit Säure katalysierte Umsetzung von Benzoatdihydrodiol zu Phenol. Für die Bereitstellung eines geeigneten Biokatalysators sollten in einen toluoltoleranten Stamm, der weder Toluol noch Benzoatdihydrodiol verwerten konnte, die erforderlichen Gene auf einem Transposon oder Plasmid integriert werden. Da zu Beginn dieser Arbeit kein geeigneter toluoltoleranter Bakterienstamm isoliert werden konnte, wurden die Gene für die Toluoloxidation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Von diesen Stämmen war bekannt, dass sie im Stoffwechsel von Benzoat auf der Stufe des Benzoatdihydrodiols bereits blockiert waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass beide Stämme Toluol nicht oxidierten. Allerdings zeigten sie nur eine sehr geringe Toleranz gegenüber Toluol. Die zusätzlichen Gene für die Transformation von Toluol zu Benzoat wurden mit Hilfe des rekombinanten Plasmids pCK05 (Panke et al., 1998) übertragen. Dieses Plasmid trägt auf einem Transposon die erforderlichen Struktur- und Regulatorgene aus dem TOL-Plasmid pWW0 von P. putida mt-2. Mittels Konjugation konnte die Genkassette stabil in das bakterielle Chromosom von R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 integriert werden. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten Toluol und Benzylalkohol zu Benzoatdihydrodiol. Dagegen setzten Transkonjuganten von R. eutropha B9 nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Zusätzlich wurden die Gene für die Oxidation von Toluol zu Benzoat extrachromosomal auf einem Plasmid in die beiden Stämme eingebracht. Dazu wurde die Genkassette in "broad-host-range" Vektoren kloniert. Die konstruierten Plasmide pBBSG1 und pMMSG6 wurden ebenfalls mittels Konjugation in die Stämme R. eutropha B9 und P. putida U-JT103 übertragen. Transkonjuganten von R. eutropha B9 setzten wiederum nur Benzylalkohol nicht aber Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Transkonjuganten von P. putida U-JT103 oxidierten zwar Toluol zu Benzoatdihydrodiol, allerdings konnten im Vergleich zu den Transkonjuganten mit den zusätzlichen Genen im Chromosom keine besseren Umsatzraten erreicht werden. Die Expression der Gene wurde auch in E. coli DH5a untersucht. Hierfür mussten neben den Genen der Enzyme für die Oxidation von Toluol zu Benzoat auch die Gene für die Benzoat-Dioxygenase kloniert werden. In dieser Arbeit gelang es nicht, die Gene für die Enzyme des vollständigen Abbauweges auf einem Plasmid bereitzustellen. Die Gene für die Oxidation von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol konnten aber separat auf einem weiteren Plasmid (pBBSG2) kloniert werden. Somit standen zwei verschiedene rekombinante E. coli DH5a-Stämme zur Verfügung: einer für die Transformation von Toluol zu Benzoat und ein weiterer für den Umsatz von Benzoat zu Benzoatdihydrodiol. Eine Mischkultur aus beiden rekombinanten Stämmen setzte Toluol zu Benzoatdihydrodiol um. Des weiteren war es gelungen, die beiden Plasmide zusammen in einen Stamm (ebenfalls E. coli DH5a) zu transformieren. Auch mit diesem Konstrukt konnte Toluol zu Benzoatdihydrodiol umgesetzt werden. Die geringe Toluoltoleranz von P. putida U-JT103 und E. coli DH5a während des Umsatzes von Toluol zu Benzoatdihydrodiol führte zu einer hohen Instabilität der konstruierten Stämme. Die Ausbeuten an Benzoatdihydrodiol lagen zwischen 70 und 99 %. P. putida U_TP10 (Transkonjugante mit der Genkassette im Chromosom) wurde für einen möglichen Einsatz als Biokatalysator in einem großtechnischen Prozess weiter untersucht. Mit den Ergebnissen konnte eine volumetrische Reaktorproduktivität von 0,02 mol×l-1×h-1 abgeschätzt werden. Aufgrund der geringen Produktivität und hohen Instabilität des Biokatalysators ist ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung des Massenprodukts Phenol gegenüber den etablierten chemischen Verfahren aus wirtschaftlicher Sicht nicht konkurrenzfähig. Allerdings können die konstruierten Stämme für die Produktion von chiralen Diolen eingesetzt werden, die chemisch nur mit unvergleichlich hohem Aufwand herzustellen sind.Item Open Access Die Rolle des Nucleus accumbens bei der Akquisition und Expression von instrumentellem Verhalten der Ratte(2003) Giertler, Christian; Hauber, Wolfgang (Prof. Dr.)Der Nucleus accumbens wird als Schnittstelle aufgefasst, über den limbische und corticale Strukturen, die eine belohnungsbezogene Analyse von sensorischen Signalen vornehmen, Zugang zum motorischen System erhalten. Aufgrund der bekannten Verschaltung der beteiligten Transmittersysteme kommt als Überträger dieser "corticalen Informationen" insbesondere der Neurotransmitter Glutamat in Frage. Darüber hinaus erhält der Nucleus Accumbens dopaminerge Afferenzen, die an einer Vielzahl von Funktionen der neuronalen Belohnungsprozessierung beteiligt zu sein scheinen. Ob der Nucleus accumbens dabei an der Vermittlung von zielgerichtetem Verhalten beteiligt ist oder nur eine Aktivierung bewirkt, die den allgemeinen motivationalen Einfluss von emotional bedeutenden Reizen auf das Verhalten vermittelt, ist nach wie vor unklar. Insbesondere elektrophysiologische Arbeiten weisen darauf hin, dass Neuronen im Nucleus accumbens eine Rolle bei der Vermittlung von zielgerichtetem Verhalten zukommt. Anderseits gibt es aber auch Hinweise, die darauf hindeuten, dass der Nucleus accumbens für die Zielgerichtetheit von instrumentellem Verhalten nicht zwingend notwendig zu sein scheint. Dies wird insbesondere durch Läsionen des Nucleus accumbens bestätigt, die zeigen dass die Zielgerichtetheit des Verhaltens durch die Läsionen nicht beeinträchtigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Rolle des Nucleus accumbens bei der Steuerung von zielgerichtetem Verhalten zu untersuchen. Dazu wurde der Frage nachgegangen, inwieweit die Steuerung von zielgerichtetem Verhalten durch belohnungsprädiktive Hinweisreize durch pharmakologische Beeinflussung der Neurochemie des Nucleus accumbens beeinträchtigt wird oder nicht. Die Wirkung der Beeinflussung wurde sowohl während des Erlernens (Akquisition) als auch während Ausführung (Expression) von instrumentellen Verhaltensweisen untersucht. Die Erwartung von Belohung ist ein wichtiger Faktor bei der Führung von instrumentellem Verhalten. Dies zeigt sich unter anderem dadurch, dass die Reaktionszeit von instrumentellem Verhaltensantworten durch die zu erwartende Belohungsmenge determiniert wird. In der hier vorgestellten Arbeit wurde den Ratten eine Hebeldruck-Reaktionszeit-Aufgabe beigebracht, die durch Hinweisreize geführt wurde, die mit zwei unterschiedlichen Belohungsstärken (1 versus 5 Pellets) assoziiert waren. Die zu erwartende Belohungsstärke wurde für jeden Versuchsdurchgang zufällig ausgewählt und zuvor durch einen optischen Hinweisreiz angezeigt. Die unbehandelten, trainierten Ratten (Kontrolltiere) zeigten stets eine deutliche Führung der Reaktionszeiten durch die erwarte Belohungsmenge, d.h. die Reaktionszeiten der instrumentellen Hebelbewegungen waren umso kürzer, je höher die zu erwartete Belohungsmenge war. Das erste Experiment zeigte, dass eine bilaterale Blockade der non-NMDA Rezeptoren mit CNQX oder der NMDA-Rezeptoren mit AP5 im Nucleus Accumbens zu einer generellen Zunahme der Reaktionszeiten führte, jedoch die Führung der Reaktionszeiten durch Hinweisreiz-assoziierte Belohnungsstärken erhalten blieb. Eine indirekte Stimulation der dopaminergen Rezeptoren im Nucleus Accumbens (durch Amphetamin) führte zu einer Abnahme der Reaktionszeiten und beeinträchtigte die Führung der Reaktionszeiten durch die Hinweisreiz-assoziierte Belohnungsstärken. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Nucleus Accumbens offenbar die Intensität instrumenteller Verhalten, sowohl über ionotrope Glutamatrezeptoren als auch über Dopaminrezeptoren vermittelte Signale, moduliert. Demgegenüber scheinen zumindest die ionotrope Glutamatrezeptoren im Nucleus Accumbens an Steuerung von zielgerichtetem Verhalten durch belohnungsprädiktive Hinweisreize nicht beteiligt zu sein. Im zweiten Experiment geht hervor, dass eine Inaktivierung des Nucleus Accumbens, durch das Lokalanästhetikum Lidocain, keine Effekte hatte auf die Reaktionszeiten sowie deren Führung durch die Hinweisreiz-assoziierte Belohnungsstärken hatte. Als mögliche Erklärung für dieses unerwartete Ergebnis wird angenommen, dass eine komplette Inaktivierung des Nucleus Accumbens zu einer funktionellen Reorganisation des beteiligen Netzwerkes führt und damit neue Übertragungswege, unter Umgehung des Nucleus Accumbens, verwendet werden, um die Intensität instrumentellen Verhaltens beeinflussen zu können. Im dritten Experiment wurde der Einfluss einer Blockade der NMDA- bzw. einer non-NMDA-Rezeptoren auf die Akquisition der Hebeldruck-Reaktionszeit-Aufgabe untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Blockade der NMDA- und non-NMDA-Rezeptoren während der frühen Akquisition (Tag 1-6) die Intensität der der instrumentellen Antwort verringerte, jedoch die tendenzielle Führung der Reaktionszeiten nicht beeinträchtigte. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass eine Blockade der NMDA- und non-NMDA-Rezeptoren während der frühen Phase der Akquisition (Tag 1-6) offenbar die Etablierung einer signifikanten und dauerhaften Führung der Reaktionszeiten durch die erwartete Belohnunkstärke während der späten Phase der Akquisition erheblich verzögerte. Die reduzierte Intensität der Verhaltensantworten während der frühen Phase der Akquisition, ist möglicherweise Ausdruck einer verminderten motivationalen Aktivierung, die während der Akquisition den zugrunde liegenden Lernvorgang indirekt selbst beeinflusst, indem lernbegünstigende Faktoren wie z.B. Aufmerksamkeit und Affektivität vermindert werden. Mögliche Interpretation der Ergebnisse: Die Intensität von instrumentellem Verhalten wird von multiplen Mechanismen beeinflusst. Einer dieser Mechanismen scheint die motivationale Aktivierung zu sein, die durch Pawlowsch konditionierte Hinweisreize des Kontextes hervorgerufen wird. Der Einfluss solcher Pawlowsch konditionierten Hinweisreize wird offenbar durch den Nucleus accumbens vermittelt, der dadurch die Intensität von instrumentellen Verhalten beeinflusst. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit geht hervor, dass an diesem Vorgang die ionotrope Glutamatrezeptoren des Nucleus accumbens offenbar maßgeblich beteiligt sind. Demgegenüber scheint der Nucleus accumbens an der Dekodierung der Hinweis-Belohnungsstärke-Kontingenz nicht beteiligt zu sein und wird damit für die Expression von zielgerichtetem Verhalten vermutlich nicht benötigt.Item Open Access Systematische Analyse von Epoxidhydrolasen : Erstellung einer familienspezifischen Datenbank, Entwicklung einer strukturbezogenen Klassifizierung und Amplifikation unbekannter Epoxidhydrolasen(2003) Barth, Sandra; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Im Laufe dieser Arbeit wurde eine systematische Analyse an 93 Epoxidhydrolase (EH) Sequenzen durchgeführt. Ein Vergleich der drei bekannten EH Strukturen aus Agrobacterium radiobacter, Mus musculus und Aspergillus niger zeigte die hohe Konservierung des a/b Hydrolase Folds und die Existenz zweier variabler Loop-Regionen, dem NC-und dem Cap-Loop. Aus dem Multisequenz-Alignment der 93 EHs wurden die Loop-Längen aller EHs bestimmt und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Hierbei bildeten sich drei nach Superfamilien und Organismengruppen getrennte Cluster. Jedes Cluster enthält eine der drei bekannten Strukturen. Unter der Annahme, dass ähnliche Loop-Längen eine ähnliche Struktur bedingen, konnten Homologiemodelle von fünf EHs erstellt werden. Vergleiche der Substratspektren mit der Cluster Zugehörigkeit führten zu der Annahme, dass Loop-Länge und Substratspezifität korrelieren, da z.B. nur für EHs mit langen Cap-Loops der Umsatz epoxidierter Fettsäuren beschrieben wurde. Mit dem Programm CODEHOP wurden degenerierte familienspezifische Primer erstellt und an zwei bakteriellen Organismen getestet. Aus Streptomyces antibioticus Tü4, welcher eine EH Aktivität gegen Styroloxid aufweist und Rhodococcus ruber LU760 konnten jeweils Fragmente mit signifikanter Homologie zu EHs amplifiziert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit befaßt sich mit der Erstellung und Auswertung einer familienspezifischen Datenbank auf der Grundlage der Lipase Engineering Database (LED). Die Epoxidhydrolase/Haloalkandehalogenase (EH/HD) Datenbank enthält 397 Sequenz-einträge, 305 Proteineinträge und für 19 dieser Proteineinträge 51 Strukturdatensätze. Neben EHs und HDs enthält die Datenbank weitere Enzymfamilien, die in 14 homologe Familien und zwei Superfamilien eingeteilt wurden. Untersuchungen der Strukturen aus EH/HD Datenbank und LED zeigten, dass trotz massiver struktureller Unterschiede, zwischen den Strukturen dieser beiden Datenbanken, das katalytische Zentrum strukturell in allen a/b Hydrolasen erhalten ist. Auch das für Lipasen ermittelte Anker-Konzept für die Stabilisierung des Oxyanionholes greift bei den Proteinen der EH/HD Datenbank. Für das hochkonservierte GXGXS-Motiv konnte eine mögliche strukturrelevante Funktion entwickelt werden, die seine konservierte Struktur und Lage erklärt.Item Open Access Interaktion von dendritischen Zellen mit dem humanen Zytomegalievirus(2003) Beck, Kerstin; Scheurich, Peter (Prof. Dr.)Dendritische Zellen (DC) sind als professionelle antigenpräsentierende Zellen von zentraler Bedeutung bei der Aktivierung der Immunantwort. Das humane Zytomegalievirus (HCMV), welches zur Familie der Herpesviren gehört, hat verschiedene immunmodulatorische Mechanismen entwickelt, dem Angriff durch das Immunsystem zu entgehen. In dieser Arbeit sollten die Interaktionen von DC mit HCMV untersucht werden. Dendritische Zellen unterteilen sich in myeloide und plasmazytoide DC (pDC). Myeloide DC wurden aus Monozyten des peripheren Blutes differenziert und pDC wurden aus Tonsillen isoliert. Durch einen Virusgenomanstieg, den Nachweis von IE-, E- und Late-Proteinen und die Anwesenheit viraler Partikel im Zellkern konnte eine produktive Infektion von unreifen (iDC) und reifen (mDC) myeloiden DC mit Endothelzell-adaptierten HCMV-Stämmen (ECV) bewiesen werden. Die Infektion von DC mit Fibroblasten-adaptierten HCMV-Stämmen (FFV) dagegen war nicht produktiv. Dies konnte aus dem Fehlen eines Genomanstiegs, aus dem Nachweis von IE-Proteinen und aus der Abwesenheit von E- und Late-Proteinen geschlossen werden. HCMV ist auch in der Lage, DC in vivo zu infizieren. In DC, die aus dem Blut hochvirämischer Patienten isoliert wurden, konnte HCMV-DNA nachgewiesen werden. Weiterhin sollten die Auswirkungen einer HCMV-Infektion auf DC untersucht werden. Sowohl FFV als auch ECV vermindern bei myeloiden iDC und mDC die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, von CD1a, den Adhäsionsmolekülen CD11c, CD33, CD54 und CD58, den Kostimula-tionsmolekülen CD4, CD40 und CD80, dem Reifungsmarker CD83 und der Aminopeptidase N (CD13). Die Expression des Kostimulationsmoleküls CD86, des Homing-Faktor CCR7 und der MHC-Klasse-II-Moleküle dagegen wurde durch HCMV nicht beeinflusst. Die Funktion von HCMV-infizierten DC ist stark eingeschränkt. ECV- und FFV-infizierte myeloide iDC und mDC konnten keine allogene T-Zellen mehr stimulieren. Dieser Effekt wurde durch einen löslichen Faktor ausgelöst, der von infizierten DC gebildet wird. Die Produktion von IL-6, IL-10, IL-12 und TNF-alpha war in ECV- und FFV-infizierten myeloiden iDC und mDC vermindert. Plasmazytoide DC (pDC) sind ebenfalls permissiv für ECV. Dies konnte aus der Anwesenheit von IE- und L-Proteinen geschlossen werden. Auch in HCMV-infizierten pDC gab es Funktionsein-schränkungen. Ihre Fähigkeit IFN-alpha zu produzieren war reduziert. In dieser Arbeit konnte eine neue Strategie des HCMV aufgezeigt werden, der Immunantwort des Menschen zu entgehen. Diese Mechanismen könnten sowohl zur Virus-vermittelten Immunsuppres-sion als auch zur Etablierung der lebenslangen Persistenz im Wirt beitragen.Item Open Access Spectinomycin und Netropsin - Biosynthese und Resistenz in den Produzentenstämmen der Gattung Streptomyces(2003) Stumpp, Tina V. M.; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)Die beiden Antibiotika Spectinomycin und Netropsin werden von verschiedenen Streptomyceten synthetisiert. Einige der Produzentenstämme wurden hinsichtlich ihrer phäno- und genotypischen Eigenschaften näher charakterisiert und verglichen. Dabei konnten zwischen den Stämmen Streptomyces flavopersicus NRRL B-2820, Streptoverticillium baldaccii ATCC19756 und Streptomyces netropsis DSM40093 keine Unterschiede fest-gestellt werden. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurde hauptsächlich der Stamm S. flavopersicus NRRL B-2820 herangezogen. Nach einer Optimierung der Kulturbedingungen wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Spectinomycin von S. flavopersicus NRRL B-2820 in hinreichender Menge gebildet. Durch Modifikation bekannter Methoden konnte der Wirkstoff aus den Kulturüberständen des Stammes aufgereinigt und anhand von Agarplatten-Diffusionsassays, Dünnschichtchromatographie und HPLC-Analytik nachgewiesen werden. Ein Problem im Nachweis der Spectinomycin-Produktion stellte die Synthese eines zweiten Antibiotikums dar, das vorher nicht in S. flavopersicus gefunden worden war. Aufgrund der Eigenschaften dieses Wirkstoffs und der Ähnlichkeit von S. flavopersicus NRRL B-2820 mit S. netropsis DSM40259, einem Netropsin-Produzenten, wurde vermutet, dass es sich dabei um das Peptid-Antibiotikum Netropsin handelt. Ein bereits bekannter und sequenzierter Teil des Spectinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. flavopersicus NRRL B-2820 diente als Ausgangspunkt, um in einer Genbank nach weiteren Synthesegenen zu suchen. Ein Cosmid mit dem vermeintlich gesamten Biosynthese-Cluster bestehend aus 16 offenen Leserahmen (spcRNTABCDXEYFGHIJK) wurde identifiziert. Über Homologie-Vergleiche und der Suche nach konservierten Regionen konnten den daraus abgeleiteten Proteinen mögliche Funktionen zugeteilt und sie Protein-Familien zugeordnet werden. Danach gibt es einen Transkriptionsregulator, ein Protein für Spectinomycin-Resistenz, ein Transportprotein, eine Monophosphatase, zwei Dehydrogenasen, zwei Aminotransferasen/Dehydratasen, eine Epimerase, eine Keto-Isomerase, eine 4,6-Dehydratase, eine Glykosyltransferase, eine Methyltransferase, eine Thymidylyltransferase, ein Zuckerbinde-protein und ein Protein mit Ähnlichkeit zu Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseproteinen. Das Synthese-Cluster wurde mit den bereits bekannten Spectinomycin-Biosynthesegenen aus S. spectabilis NRRL2494 und S. spectabilis NRRL2792 verglichen. Anhand aller verfügbaren Daten konnte ein möglicher Biosyntheseweg für Spectinomycin postuliert werden. Das für die Spectinomycin-Resistenz verantwortliche Enzym in S. flavopersicus NRRL B-2820 und S. spectabilis NRRL2494 ist eine Spectinomycin-Phosphotransferase SpcN. Das Protein aus S. spectabilis wurde in Escherichia coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mit Hilfe verschiedener Aktivitätstests wurde festgestellt, dass das Enzym mit ATP spezifisch Spectinomycin und Dihydrospectinomycin phosphoryliert. Eine Inaktivierung anderer Aminoglykosid-Antibiotika so wie eine kompetitive Inhibition des Enzyms durch die Substanzen konnte nicht nachgewiesen werden. Der KM-Wert der Spectinomycin-Phosphotransferase für Spectinomycin betrug etwa 20 µM. Die Gene für die beiden Dehydrogenasen, SpcB und SpcH, aus dem Spectinomycin-Gencluster von S. flavopersicus konnten in E. coli nur in geringer Menge exprimiert werden. Im postulierten Biosyntheseweg von Spectinomycin könnten sie mehrere Oxidations-/Reduktionsreaktionen katalysieren. Mit einigen der möglichen Substrate, myo-Inositol, scyllo-Inosose, Spectinomycin und Dihydrospectinomycin, konnte in in vitro mit NAD(P)+ bzw. NAD(P)H als Coenzym jedoch keine Aktivität festgestellt werden. Die Inaktivierung einiger Biosynthesegene über verschiedene Methoden zeigte keinen Erfolg. Dies lag zum einen daran, dass für S. flavopersicus kein zufriedenstellendes Transformationsprotokoll erstellt werden konnte, und zum anderen daran, dass durch das Fehlen von Sporen die Mutanten inhomogen waren, und in einem Myzel Wildtyp- und mutierte Sequenz parallel vorkamen. Daher konnten die Ansätze zur kombinatorischen Biosynthese, d.h. der Austausch des Methyltransferasegens spcG in S. flavopersicus gegen das Amidinotransferasegen strB1 aus S. griseus, nicht verwirklicht werden. Dagegen führte der umgekehrte Austausch von strB1 gegen spcG in S. griseus zu Mutanten, die keine antibiotische Aktivität mehr aufwiesen. Des Weiteren wurden die Netropsin-Resistenzgene netP1 und netP2 aus S. flavopersicus NRRL B-2820 isoliert. Die daraus abgeleiteten Proteine zeigten Homologie zu ABC-Transportern und wiesen charakteristische Motive dieser Proteine auf, insbesondere eine Transmembran- und eine ATP-Bindedomäne. Verschiedene Mutanten in netP1 und netP2 wurden in unterschiedlichen Tests auf ihre Netropsin-Resistenz untersucht. Aufgrund der Ergebnisse wird postuliert, dass NetP1 und NetP2 als Heterodimer wirken, aber zu einem sehr geringen Teil auch als Homodimer aktiv sind.Item Open Access Neuartige Poly(3-Hydroxybutyrat) Depolymerasen aus Paucimonas lemoignei und Rhodospirillum rubrum(2003) Handrick, René; Jendrossek, Dieter (PD Dr.)Aus Paucimonas lemoignei-Kulturüberstand wurde eine neuartige unter Kohlenstoffmangel während des späten exponentiellen Wachstums auf organischen Säuren oder parakristallinen dPHASCL {denaturierte Poly[(R)-3-Hydroxyalkanoate]; Monomeruntereinheiten C3-C5} gebildete PHASCL Depolymerase (PhaZ7; 36.2 kDa, stabil bis pH 12, 60°C) isoliert. Das Enzym hydrolysierte amorphe nPHASCL (zu 3-HA Pentamer) und ataktische P[(R,S)-3-HB]. PHAMCL (> C6), Polynukleotide, Proteasesubstrate, Poly(6-Hydroxyhexanoat), Lipide wurden nicht hydrolysiert. phaZ7 mit SacB-Signalsequenz wurde heterolog in Bacillus subtilis expremiert. Partielle Homologien zu Bacillus Lipasen und ortsgerichte Mutagenese präferieren S136, D242, H306 (H47G48 Oxyanion) als katalytische Triade. PhaZ7 entspricht dem „dPHB Depolymerase Inhibitor“ (MUKAI et al., 1992). Substratspezifität/kinetischen Studien wiesen auf eine Kooperativität der PHASCL Depolymerasen aus P. lemoignei hin. Intrazelluläre nPHASCL Depolymerase aus Rhodospirillum rubrum (PhaZ1Rr) wurde gereinigt und charakterisiert. Die nPHB-Hydrolyse in vitro erforderte zwei lösliche Komponenten: thermostabilen „Aktivator“ und thermolabile Depolymerase (MERRICK & DOUDOROFF, 1964). Vorinkubation von nPHB mit Aktivator oder Proteasen erhöhte die Hydrolyserate (> 6x). Der Aktivator war Protease-sensitiv, stabil in Alkanen, Ketonen, Alkoholen und schwach polaren Lösungsmitteln. PhaZ1Rr (35kDa, Topt.50°C, pHopt.9) hydrolysierte nPHB (3.1mmol cuts min-1 mg-1) unabhängig von Granula-Ursprung und Art der Aktivierung zu 3-HA-Mono-, Di- und Trimer, besaß jedoch keine Lipase-, Protease- oder Esteraseaktivität (lösliche Ester). phaZ1Rr wurde in E. coli heterolog expremiert. Die Aminosäuresequenz war homolog zu dPHASCL-Depolymerasen Typ 2. Linker- und Substratbindedomäne fehlten. Die Lipasebox (GIS19SG) entsprach PHAMCL Depolymerasen. Sequenzhomologien und Sekundärstrukturanalysen weisen auf S19, D115, H155 (H250G251 Oxyanion) als katalytische Triade hin.Item Open Access Entwicklung hochsensitiver Biosensoren für neurotoxische Insektizide in Lebensmitteln : enzymatische in-vitro Aktivierung von Phosphorthionaten mit der Monooxygenase P450-BM3 und Sensitivitätssteigerung durch Proteindesign von Acetylcholinesterase(2003) Schulze, Holger; Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines sensitiven AChE-Biosensors für den quantitativ summarischen Nachweis neurotoxischer Organophosphate und Carbamate in Lebensmitteln und Säuglingsnahrung. Für die Untersuchung von Lebensmittelproben musste ein Verfahren entwickelt werden, welches unspezifische Matrixeinflüsse verhindert. Dies gelang durch Eingliederung einer Elektrodenbehandlung mit dem Tensid Tween 20 in das Testprotokoll. Dieser Schritt reduzierte die Probenvorbehandlung auf ein Minimum und lieferte ausgezeichnete Wiederfindungsraten von durchschnittlich 85% in den getesteten Lebensmittelproben. Der Biosensortest wurde mit Realproben vom Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Stuttgart erfolgreich validiert. Die Anwendbarkeit konnte im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem CVUA Stuttgart gezeigt werden, in der Babybrei-Proben aus vier Ländern untersucht wurden. Hierbei wurden drei Überschreitungen des EU-Grenzwertes für Säuglingsnahrung festgestellt. Für Phosphorthionate konnte eine neuartige Aktivierungsmethode entwickelt werden. Phosphorthionate stellen den Hauptanteil der als Insektizide eingesetzten Organophosphate dar, sind in ihrer ursprünglichen Form dem AChE-Hemmtest aber nicht zugänglich. Die Dreifachmutante F87V, L188Q, A74G war im Gegensatz zum Wildtyp Cytochrom P450 BM-3 in der Lage, die Oxidation von Phosphorthionaten in die korrespondierenden starken AChE-Inhibitoren zu katalysieren. Die Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC-MS/MS ergab eine quasi quantitative Umsetzung von Parathion und Chlorpyrifos zu Paraoxon bzw. Chlorpyrifos-oxon. Der indirekte Nachweis der enzymatisch aktivierten Phosphorthionate über die AChE-Hemmwirkung lieferte eine Transformationseffizienz von 85% für Parathion und 99% für Chlorpyrifos. Dieses Verfahren wurde erfolgreich in Lebensmittelproben getestet. Dies bedeutet eine deutliche Steigerung des Analytspektrums von AChE-Biosensoren. Die Sensitivität des AChE-Biosensors konnte durch Protein-Design von Nippostrongylus brasiliensis AChE gesteigert werden. Es wurden zehn Einfachmutanten und eine Mutante mit zusätzlicher Insertion von 26 Aminosäuren mittels ortsspezifischer Mutagenese hergestellt und in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Ausbeute des Wildtyps konnte durch optimierte Kultivierungsbedingungen in einem 5L Fermenter auf 0,6 g/L gesteigert werden. Dieser Wert liegt deutlich über allen bislang erreichten Expressionsraten rekombinanter AChEn. Die AChE-Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Sensitivität gegenüber den 11 wichtigsten Organophosphaten und Carbamaten getestet. Die Mutation M301(288)A in der Acyltasche des aktiven Zentrums der AChE lieferte die insgesamt sensitivste Mutante. Gegenüber Omethoat ergab sich eine 108-fache Sensitivitätssteigerung. Die Sensitivität gegenüber Pirimiphos-methyl konnte ebenfalls um zwei Größenordungen gesteigert werden. Insgesamt konnte die Sensitivität gegen 10 von 11 getesteten Insektizide erhöht werden. Damit konnte das Ziel, Konzentrationen im Bereich des Pestizidgrenzwertes von Säuglingsnahrung von 10 µg/kg zu detektieren, für acht 8 der 11 getesteten Insektizide erreicht werden.Item Open Access Das Streptomyces coelicolor A3(2) Plasmid SCP2* : Ermittlung der vollständigen Sequenz und daraus abgeleitete Funktionen(2003) Haug, Iris; Mattes, Ralf (Prof. Dr.)SCP2 war das erste aus Streptomyces coelicolor A3(2) isolierte zirkuläre Plasmid, ein Fertilitätsfaktor ähnlich dem F-Plasmid aus Escherichia coli mit einer Kopienzahl von eins bis vier Plasmiden pro Chromosom. Das in dieser Arbeit untersuchte SCP2*-Plasmid ist ein spontan aufgetretenes Derivat von SCP2, welches sich durch erhöhte Fertilität und Mobilisierung chromosomaler DNA auszeichnet. Beide Plasmide sind seit langem Grundlage wichtiger Vektoren in der Streptomyceten-Genetik, die sich vor allem durch ihre Fähigkeit auszeichnen, große, insertierte Fragmente stabil weiterzugeben. Die Gesamtsequenz von SCP2* wurde ermittelt und ist in der GenBank unter der Nummer AL645771 hinterlegt. Teilsequenzen waren bereits vorher von anderen publiziert worden. Bei der Analyse der 31317 bp langen Sequenz von SCP2* wurden 34 offene Leserahmen identifiziert, deren abgeleitete Proteinsequenzen von 31 bis 710 Aminosäuren reichen. Den meisten dieser Proteine kann keine bekannte Funktion oder Verwandtschaft zu anderen Proteinen zugeordnet werden. Drei funktionelle Regionen waren bereits vorher identifiziert worden: die Stabilitäts-, die Transfer- und die Replikationsregion. Des Weiteren konnten zwei transponierbare Elemente identifiziert werden, IS1648 und Tn5417. Die Stabilitätsregion, welche zwischen den beiden transponierbaren Elementen positioniert ist, enthält zwei funktionelle Einheiten. Bei der ersten handelt es sich um das Protein MrpA (multimer resolution protein A), das ein neues Mitglied der l-Integrasen darstellt. Das Gen mrpA wurde in E. coli exprimiert und die Aktivität der Integrase untersucht. Die Erkennungssequenz mrpS der Integrase wurde über Mobility Shift-Experimente und durch Footprinting identifiziert. Sie besteht aus zwei 9 bp langen invers orientierten Sequenz-wiederholungen, die eine 18 bp große Kernregion flankieren. Zwei Integrase-Moleküle binden nicht-kooperativ in mrpS und induzieren dabei eine Beugung der DNA. Durch Expressionsstudien mit Hilfe einer Transkriptionsfusion mit xylE als Reportergen wurde eine Autoregulation durch MrpA nachgewiesen. In vivo Untersuchungen in E. coli zeigten die Fähigkeit von MrpA, in trans aus Plasmiden, die eine mrpS-Sequenz tragen, Multimere zu bilden und diese auch in Monomere aufzulösen. Liegen zwei mrpS-Sequenzen auf einem Plasmid vor, kommt es bei Zugabe von MrpA zur Deletion bzw. Inversion der DNA-Fragmente, die sich zwischen den cis-aktiven Erkennungssequenzen der Integrase befinden. Die zweite funktionelle Einheit der Stabilitätsregion bilden die Partitionsgene parA und parB, die zur Stabilität von SCP2* beitragen. Das Partitionssystem gehört zur Familie des Walker Ib-Typs. Das parA-Gen codiert eine ATPase. Das Gen wurde in E. coli exprimiert und die Magnesium-abhängige ATPase-Aktivität in Rohextrakt und gereinigtem Enzym untersucht. Das parB-Gen von SCP2* zeigt keine Verwandtschaft zu anderen parB-Genen und konnte in E. coli nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden. Mit eGFP-Fusionen konnte die Verteilung von ParA und ParB in E. coli sichtbar gemacht werden. Expressionsstudien mit Hilfe von xylE-par-Fusionen in Streptomyces lividans deuten auf eine Regulation des par-Operons durch ParB hin. Der Beitrag, den die einzelnen Gene aus der Stabilitätsregion zur Stabilität des Plasmids SCP2* leisten, wurde untersucht, indem die Gene einzeln oder in Gruppen in Vektoren eingefügt wurden. Befinden sich alle drei Stabilitätsgene (mrpA, parA, parB) auf einem Plasmid, werden die Plasmide mit einer Wahrscheinlichkeit von 96 % in die Sporen segregiert. MrpA leistet dabei den wichtigsten Beitrag. Durch die Ermittlung der SCP2*-Sequenz konnten im Replikationsbereich von SCP2* zwei offene Leserahmen und eine nicht-codierende Region von 650 bp identifiziert werden, welche notwendig und ausreichend für die Replikation des Plasmids sind. Die entsprechenden Proteine RepI (161 Aminosäuren) und RepII (136 Aminosäuren) konnten in E. coli exprimiert werden. Die Interaktion von RepI mit dem nicht-codierenden DNA-Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* wurde durch Mobility Shift-Experimente und Footprint-Untersuchungen gezeigt. Die Bindung erfolgt an drei Sequenzwiederholungen. Weiterhin können die Rep-Proteine in S. lividans ein Plasmid in trans komplementieren, welches nur den nicht-codierenden Bereich aus der Replikationsregion von SCP2* enthält und folglich alleine replikationsdefizient ist. Mit diesen Ergebnissen als Basis wurden verschiedene SCP2-Shuttle-Vektoren konstruiert, die in E. coli eine hohe Kopienzahl und in S. lividans wie auch das Ausgangsplasmid SCP2 eine niedrige Kopienzahl haben. Diese sollten besonders für die Klonierung großer Fragmente geeignet sein, unterscheiden sich aber durch die viel geringere Größe und damit bessere Handhabung von den bisher verwendeten SCP2-Vektoren.