Universität Stuttgart
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Item Open Access Identifizierung neuer Proteine des Polyphosphat Granulumkomplexes von Ralstonia eutropha H16(2017) Tumlirsch, Tony; Jendrossek, Dieter (Prof. Dr.)Item Open Access Microarray and molecular genetic analysis of aberrant splicing in human drug metabolizing cytochromes P450 CYP2D6 and CYP2B6(2008) Hofmann, Marco Hans; Schmid, Rolf (Prof. Dr.)This study was devoted to the detection of alternative splicing within the Cytochrome P450 enzymes 2D6 and 2B6, mapping of the most common splice variants and to draw connections to certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) and alleles. For both enzymes a splicing sensitive microarray was developed. The microarray was produced and optimized in all steps including the oligonucleotide probe design, microarray processing and target preparation, optimization of hybridization conditions and the development of a new data quantification method for the used probe design. For the developed splicing platform a design was chosen based on 5 different probes. Within the CYP2D6 gene it was known that the SNP 2988G>A (allele *41) in intron 6 shifts splicing towards a variant lacking exon 6, what explains the intermediate phenotype within allele *41. The splicing platform verified this splicing aberration in allele *41. Using the microarry specific splicing patterns were monitored in human liver tissue within the most common alleles of CYP2D6 *1, *2, *4 and *41. It could be observed that within mRNA from allele *41 carriers additionally to the known transcript variant, which is lacking exon 6, total or partial retention of intron 5 and 6 was enhanced. Transcript patterns of CYP2D6*1 and *2 were similar with 5 times higher amount of the full functional transcript (NP), including all nine exons, compared to allele *41. The splicing array showed to be a valuable tool not only for detection of splicing variants in human liver tissue but additionally for detection for allele specific splicing patterns. The existence of highly homologous Cytochrome P450 pseudogenes, which in some cases, as in CYP2D7 also express alternative splicing variants, results in a major problem of interpreting the data from splicing arrays. The developed splicing platform is the first existing array with which gene and pseudogene specific transcript patterns can be monitored individually. The microarray platform can be easily transferred to other genes as shown for the second gene CYP2B6. Alternative splicing in this gene was so far only reported descriptive. CYP2B6 is a polymorphic human drug metabolizing cytochrome P450 with clinical relevance for several drug substrates including cyclophosphamide, bupropion and efavirenz. The common allele CYP2B6*6 [c. 516G>T, Q172H and c.785A>G, K262R] has previously been associated with lower expression in human liver and with increased plasma levels of efavirenz in HIV patients, but the molecular mechanism has remained unclear. With the developed splicing array for CYP2B6 allele specific splicing patterns were observed comparing CYP2B6*6 and CYP2B6*1. This lead to the idea that alternative splicing might play an important role in allele *6. This was investigated in more detail using RNA originating from well-documented human liver tissue. Analysis of mRNA in this tissue demonstrated that additional unknown splicing variants exist (SV8, SV7, SV9). Investigations in human liver tissue using RT-PCR and sequencing showed that the most common transcript in CYP2B6*6 was not the normal transcript (NP) but an alternative splicing transcript lacking exons 4 to 6 (SV1). SV1 was tightly associated with the allele*6 and apparently also with the rare variant c.777C>A (CYP2B6*3). The observations lead to the assumptions that alternative splicing might explain the decreased function observed in allele CYP2B6*6. Further investigations in this direction were performed by cloning CYP2B6 minigene constructs including all nine exons and additional intronic regions. Minigenes carrying the single c.785A>G polymorphism or the rare c.777C>A variant resulted in normal and intermediate expression phenotypes, respectively. In conclusion, the mechanism of the common allele*6 involves predominantly a pretranslational mechanism resulting in decreased enzyme expression. Aberrant splicing is leading to reduce functional mRNA, protein and activity. These results establish the SNP c.516G>T, a nonsynonymous exonic mutation, as the causal sequence variation for severely decreased expression and function associated with CYP2B6*6. This work emphasizes the role of SNPs in non-consensus splicing elements such as exonic and intronic splicing enhancers as well as the clinical relevance of alternative splicing in context of adverse drug reactions. In both investigated genes CYP2D6 as well as in CYP2B6 there exists a common allele (CYP2D6*41 and CYP2B6*6, respectively) in which aberrant splicing results in reduced amounts of functional transcript, reduced amount of protein and enzyme activity. The findings establishes the SNP c.516G>T as the causal sequence variation that can now be reliably used in pharmacogenetic studies in various clinical settings including prediction of drug plasma concentration, toxicity, drug effectiveness and dose adjustment.Item Open Access Die HECT-Ligase Hul5, eine neue Komponente der ER-assoziierten Proteindegradation(2007) Kohlmann, Sonja; Wolf, Dieter H. (Prof. Dr.)Die meisten sekretorischen Proteine der eukaryontischen Zellen erreichen durch das endoplasmatische Retikulum (ER) den sekretorischen Signalweg. Sie gelangen vom Zytoplasma durch einen Kanal in der ER-Membran in das ER, wo sie ihre native Konformation erhalten. Das ER enthält ein strenges Qualitätskontrollsystem, welches fehlgefaltete Proteine erkennt, im ER zurückhält und letztendlich der ER-assoziierten Degradation (ERAD) zuführt. Die ER-Qualitätskontrolle und die ER-assoziierte Degradation sind eng miteinander verknüpft, und werden unter der Bezeichnung ER-Qualitätskontrolle und assoziierte Degradation (ERQD) zusammengefasst. Die ERQD ist von der Hefe bis hin zum Menschen ein hoch konservierter Prozess. Aus diesem Grund wird die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus zur Erforschung solcher sogenannter „housekeeping“ Prozesse genutzt. In dieser Arbeit wurden durch einen genomweiten Screen neue Komponenten der ER-assoziierten Degradation identifiziert. Für diesen Screen wurden die EUROSCARF Hefe-Deletionsbank und das Screeningsubstrat Sec61-2L verwendet. Die Deletionsbank besteht aus etwa 5000 diploiden S. cerevisiae Stämmen mit je einer homozygoten Einfachdeletion. Bei dem Screeningsubstrat Sec61-2L handelt es sich um das nicht glykosylierte, mutierte Translokonprotein Sec61-2 und einer C-terminalen zytosolischen Fusion mit der 3-Isopropylmalat-Dehydrogenase (Leu2). Das für Sec61-2L kodierende Plasmid wurde in die leu2-auxotrophen Deletionsstämme transformiert und der Wachstumsphänotyp bei 38° auf Leucin-defizientem Medium getestet. Aufgrund der Punktmutation faltet sich Sec61-2 bei 38°C in einer Art und Weise, dass es der ER-Degradation unterliegt. Nur wenn Sec61-2L stabil vorliegt, also in Deletionsstämmen mit einem Defekt in der Erkennung oder der Degradation des fehlgefalteten Sec61-2L, ist ein Wachstum auf Leucin-defizientem Medium möglich. Auf diese Weise konnten über 40 bisher unbekannte, potentielle Komponenten der ER-Qualitätskontrolle und ER-assoziierten Degradation identifiziert werden. Unter anderem wurde durch diesen genomischen Screen die E4-Ligase Hul5 als Komponente des ERAD für dieses nicht glykosylierte Substrat gefunden. Des Weiteren war bereits durch einen entsprechenden Screen mit dem Substrat CTL* bekannt, dass Hul5 auch am Abbau dieses glykosylierten ERAD-Substrats beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass für den vollständigen Abbau der ERAD-Substrate Sec61-2Lmyc und CTL*myc die katalytische Funktion der E4-Ligase Hul5 benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass der Abbau der Substrate Sec61-2Lmyc und CTL*myc im Wildtypstamm sowie in der HUL5 Deletionsmutante am N-Terminus einsetzt und über definierte Zwischenprodukte verläuft. Im Wildtypstamm kann auf diese Weise der Abbau der Substrate vollständig verlaufen. Im Gegensatz dazu erfolgt in der HUL5 Deletionsmutante ein Abbruch der Degradation am Proteasom, was zu einer Akkumulation der C-terminalen Abbaufragmente truncSec61-2Lmyc und truncCTL*myc führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass für den Abbau des N-terminalen Anteils von CTL*myc keine Extraktion des Proteins aus der ER-Membran notwendig ist. Demzufolge muß der N-Terminus von CTL*myc durch die ER-Membran in das Zytosol der Zelle ragen, wo die Ubiquitinierung und die Degradation des Substrats einsetzen. Außerdem wurde gefunden, dass auch das Proteasom an der Extraktion von CTL*myc aus dem ER beteiligt ist. Es ist bekannt, dass die E4-Ligase Hul5 gemeinsam mit dem deubiquitinierenden Enzym Ubp6 und dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc4 den Abbau anderer proteasomaler Substrate regulieren kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Degradation des ERAD-Substrats CTL*myc durch Hul5, jedoch nicht durch Ubp6 und Ubc4 beeinflusst wird. Dieses Ergebnis gibt Hinweise auf weitere mit Hul5 agierende deubiquitinierende und Ubiquitin-konjugierende Enzyme.Item Open Access Characterization of novel proteins involved in catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase in saccharomyces cerevisiae(2006) Pfirrmann, Thorsten; Wolf, Dieter (Prof. Dr.)Glycolysis and gluconeogenesis are reciprocally controlled central metabolic pathways in cells. Catabolite degradation of fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) is a key regulatory step, when Saccharomyces cerevisiae cells switch from anabolic gluconeogenesis to catabolic glycolysis. Addition of glucose to cells growing on a non-fermentable carbon source causes FBPase phosphorylation resulting in a decrease of enzymatic activity. This is followed by a proteolytic breakdown of the enzyme via the ubiquitin-proteasome system with a half-life of 20-30 min. In a genome wide screen nine so called gid mutants (glucose induced degradation deficient) defective in proteasome-dependent catabolite degradation of FBPase were identified. Analysis of Gid2 revealed that this protein is a part of a soluble, cytosolic protein complex with a molecular mass of at least 600kDa (Regelmann et al., 2003). The work of this thesis focuses on the analysis of the novel Gid proteins and their possible role in a higher molecular mass protein complex. To be able to detect Gid proteins immunologically, functional chromosomally HA eptitope tagged versions of Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 proteins were generated. Using step glycerol gradient centrifugation it could be shown that Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 are also components of a higher molecular mass complex of about 600kDa. Gid1/Vid30, Gid/Ubc8 and Gid4/Vid24 exhibit a sedimentation profile of lower molecular mass slightly overlapping with 600kDa aminopeptidase I. Gid6/Ubp14 is only present in its monomeric form. Use of Gid7 as a bait protein in a co-immunoprecipitation experiment, led to the identification of Gid1/Vid30, Gid2, Gid4/Vid24, Gid5/Vid28, Gid7, Gid8 and Gid9 as interacting components. The protein Gid6/Ubp14 is not part of this protein complex. The direct interaction of Gid4 with Gid5 could be shown via the two hybrid method. Expression profiles on ethanol or glucose of Gid1, Gid2, Gid5, Gid6, Gid7, Gid8 and Gid9 were similar. Gid4/Vid24 was not expressed on ethanol but appears when cells are treated with glucose. As found for Gid3/Ubc8 (Schüle et al., 2000), Gid4/Vid24 seems to disappear during incubation on glucose in a time-dependent fashion. Fructose-1,6-bisphosphatase was found to interact with Gid1 and Gid7 protein. As shown for GID2 (Regelmann et al., 2003) deletion of GID1 and GID7 leads to a block in fructose-1,6-bisphosphatase polyubiquitination. This shows that Gid proteins are directly involved in the ubiquitination process which preceeds proteasome degradation. Two discovered short RING domains in Gid2 and Gid9 (ShRING domains) as well as the discovery of 5 WD40 domains within Gid7 suggest a role of the Gid complex as a novel E3 ubiquitin ligase. The targeted mutation of conserved cysteine residues within the shRING domain of Gid2 could support this theory. Biochemical and molecular methods were used to identify the localization of Gid1, Gid6, Gid7 and Gid8. Interestingly all four Gid proteins were found to be localized in the nucleus. The direct interaction of FBPase with these Gid proteins raised the question of whether FBPase itself had a function in the nucleus of the cell or not. To investigate this question GFP-fusions with FBPase were constructed and localisation studies were performed. An increasing signal of FBPase within the nucleus after onset of catabolite degradation gave proof of the existence of this enzyme in the nucleus as well. Several mutants known to have a defect in nuclear import were tested for the catabolite degradation of FBPase. The protein kinaseA pathway was shown to be the signal transduction pathway triggering FBPase degradation. This led to the discovery of novel putative phosphorylation sites within FBPase by bioinformatics.Item Open Access Detektion und Charakterisierung von Zellwandproteinen in Candida albicans(2008) Hiller, Ekkehard; Brunner, Herwig (Prof. Dr.)Candida albicans ist ein weit verbreiteter human pathogener Organismus, der sowohl oberflächliche wie auch systemische Infektionen verursacht. Diese treten vor allem bei Personen mit geschwächtem Immunsystem auf. Bei der Infektion spielen die Zellwand und ihre Bestandteile eine besonders wichtige Rolle. Dieses komplexe Netzwerk aus Glucan, Chitin, Mannan und Proteinen stellt die Naht¬stelle der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen dar. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass mehrere der in dieses Netzwerk eingebundenen Proteine ausschlaggebend für die Adhäsion und die Interaktion mit dem Wirt und seinem Immunsystem sind. Hinweise auf Änderungen im Zell¬wand-Proteom während des Übergangs vom Wachstum als Blastosporen hin zu Hyphen wurden zuerst im Microarray Experimenten gefunden, und konnten später in Untersuchungen bestätigt werden, die sich auf die Zellwandproteine konzentrierten. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Proben¬vorbereitung verglichen, um die kovalent an die Zellwand gebundenen Proteine oder deren Peptide durch massen¬spektro¬metrische Methoden zu identifizieren. Trypsin, Endo¬proteinase Glu-C und Bromcyan zur Freisetzung von Proteinfragmenten wurden allein oder in Kombination verwendet und miteinander verglichen. Zusätzlich untersucht wurden die Auswirkungen einer Vor¬behandlung der Zell¬wand durch eine β-1,3-Glucanase. Die Identifikation der Peptide erfolgte mittels zweier verschiedener Massenspektrometer. Insgesamt konnten 33 Proteine in der Wachstumsform der Blastosporen identifiziert werden, sechs davon mit vorhergesagtem GPI-Anker. Im Gegensatz dazu wiesen 14 der 18 identifizierten Proteine aus Hyphen-Zellen diese spezifische Ankersequenz auf, 12 davon sind in dieser Wachstumsform transkriptionell induziert. Zwischen den verwendeten Methoden wurde eine hohe Varianz in der Zahl identifizierter Proteine, bzw. der Zahl zu einem Protein gehörender Peptide, gefunden. Zusätzlich wurden die von C. albicans in synthetische Flüssigmedien sekretierten Proteine identifiziert. Unter den sowohl von Blastosporen wie auch Hyphen sekretierten Proteinen befand sich Sun41p. In einer früheren Arbeit wurde gezeigt, dass die Transkription dieses Proteins in Hyphen induziert wird. Die SUN Gen Familie, zu der es gehört, wurde in S. cerevisiae definiert und beinhaltet eine für Pilze spezifische Familie von Proteinen die eine hohe Übereinstimmung in ihrer C-terminalen Domäne aufweisen. Gene dieser Familie sind in unterschiedliche zelluläre Prozesse wie DNS-Replikation, Alterung, mitochondriale Biogenese und Cytokinese involviert. In C. albicans gehören zwei Gene, SUN41 und SIM1, dieser Familie an. Da Sun41p als potentieller Virulenz¬faktor Ziel einer gegen Pilze gerichteten Therapie darstellen kann, wurde seine Funktion durch die Konstruktion einer SUN41 Deletionsmutante untersucht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass C. albicans Mutanten ohne SUN41 ähnliche Defekte aufweisen wie sie auch bei entsprechenden S. cerevisiae Mutanten gefunden wurden. Dies beinhaltet unter anderem Defekte bei der Cyto¬kinese. Zusätzlich zeigten die SUN41 Mutanten eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber der die Zellwand schädigende Substanz Kongorot, wohingegen bei der Anwesenheit von Calcofluor Weiß keine Veränderung beobachtbar war. Im Vergleich mit dem Wildtyp wies der SUN41 Deletions-Stamm Defekte bei der Bildung von Biofilmen auf, zeigte eine reduzierte Adhäsion auf einem epithelialen Gewebemodell und konnte unter den getesteten Bedingungen auf Festmedien keine Hyphen bilden. Die Ergebnisse deuten auf eine Funktion von Sun41p als Glycosidase hin, die an der Zellwand-Biogenese beteiligt ist und dadurch die Cytokinese, die Adhäsion am Wirtsgewebe, die Bildung von Biofilmen und die Virulenz beeinflusst. Dies weist auf eine wichtige Rolle von Sun41p bei der Interaktion des Pathogen mit dem Wirt hin.Item Open Access Identification of novel protein binding partners for the tumor suppressor DLC1(2009) Heering, Johanna; Pfizenmaier, Klaus (Prof. Dr.)Cancer, one of the major chronic health problems worldwide, is a genetic disease, which requires the cooperation of gain-of-function and/or loss-of-function mutations to either oncogenes or tumor suppressor genes, respectively. In the last decade, the Deleted in Liver Cancer (DLC) 1 gene has emerged as a novel tumor suppressor downregulated in a variety of cancer types including breast, liver, prostate and lung. DLC1 is a multidomain protein consisting of an N-terminal sterile alpha motif (SAM), a C-terminal START and an internal Rho GTPase activating (GAP) domain. Due to GAP-dependent and -independent mechanisms that are still poorly understood DLC1 is able to inhibit proliferation, migration and invasion of tumor cells. The goal of this thesis was the identification of novel DLC1 protein binding partners, in order to gain deeper insight into DLC1 regulation and molecular function. Therefore, a yeast-two-hybrid screen based on the Gal4-system was performed, using the DLC1 SAM domain as a bait and a cDNA library derived from human breast tissue as a prey. One of the 16 putative binding candidates identified was the phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN), which is also a tumor suppressor frequently deleted or mutated in sporadic tumors of the breast, prostate, endometrium and brain. PTEN consists of an enlarged catalytic site that acts as a dual-specificity phosphatase for proteins and lipids. By dephosphorylation of its major lipid substrate phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3) the PI3K signaling pathway is downregulated and cell proliferation and survival mediated by Akt/PKB activation are inhibited. Cell spreading and cell motility are also suppressed by PTEN activity. Pulldown assays and coimmunoprecipitation of DLC1 and PTEN confirmed association of the proteins in mammalian cells. The interaction of both proteins was stimulated upon PTEN activation by PDGF treatment, correlating with their colocalization at the plasma membrane. In overexpression experiments synergistic effects of the two proteins with regard to downstream signaling could not be observed. However, simultaneous loss of DLC1 and PTEN in the non-invasive MCF7 breast carcinoma cell line using RNA interference enhanced migration in an additive manner in wounding as well as in chemotactic transwell assays compared to singly depleted cells. These results suggest that the spatio-temporally restricted formation of a DLC1/PTEN complex, simultaneously inhibiting its individual downstream targets, guarantees the synchronization of cell migration processes. Thus, loss of both proteins is proposed to facilitate malignant transformation by increasing the metastatic potential of tumor cells. Another putative DLC1 binding partner identified in the yeast-two-hybrid screen was liprin beta2 that belongs to a protein familiy comprising four alpha- and two beta-type family members, which all contain a C-terminal highly conserved liprin homology (LH) domain consisting of three SAM domains. Association of full-length DLC1 with liprin beta2 as well as with the additional family members liprin alpha1 and beta1 was confirmed biochemically by coimmunoprecipitation. Liprins are multivalent proteins that form complex structures due to homo- and heterodimerization. Additionally, alpha-type liprins interact with the LAR subfamily of receptor protein-tyrosine phosphatases, which are heterophilic receptors involved in cell adhesion and cell motility. Given the function of liprins as adaptor proteins at membrane proximal sites, it is conceivable that they contribute to DLC1 localization and/or scaffolding. It is thus of particular interest to investigate the biological impact of DLC1 binding to liprin proteins in future studies.Item Open Access Entwicklung eines DNA-Microarrays zur Detektion von Resistenzdeterminanten in Acinetobacter baumannii(2014) Dally, Simon; Rupp, Steffen (PD Dr.)Acinetobacter baumannii ist ein opportunistisch pathogenes Bakterium, welches schwere Infektionen, insbesondere Pneumonie, Sepsis, Harnwegs- oder Wundinfekte, auslösen kann. Es besitzt die Fähigkeit, in beachtlichem Ausmaß, Antibiotika-Resistenzen zu akquirieren, was die Behandlung infizierter Patienten erheblich erschwert. Erst nach der Detektion dieser Resistenzen lässt sich eine gezielte antibiotische Therapie initiieren. In dieser Arbeit wurde ein DNA-Microarray entwickelt, der die Diagnose von Resistenzdeterminanten in A. baumannii ermöglicht. Der Zeitbedarf für die Arrayanalyse lag mit 4 Stunden dabei deutlich unter dem für konventionelle kulturbasierte Methoden. Der neu entworfene Microarray ist mit seinen 370 speziell entwickelten Sonden dazu in der Lage, 91 Zielsequenzen, die mit einer Antibiotika-Resistenz assoziiert sind, nachzuweisen. Die kurze Bearbeitungszeit, die für eine Analyse veranschlagt werden muss, gewährt die schnelle Verfügbarkeit therapierelevanter Resultate. Damit ist eine schnelle Anpassung der Medikation kritisch erkrankter Patienten und konsekutiv eine Verbesserung ihrer Prognose möglich. Auch zur Aufklärung epidemiologischer Fragestellungen könnte der Microarray eingesetzt werden.Item Open Access Resolving heterogeneities in single and multiphase bioreactor systems - Predictive modelling tools towards successful scale-up(2020) Kuschel, Maike; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Dual- and triple-targeting of the HER-family members using combinations of mono- and bispecific antibodies(2023) Rau, Alexander; Olayioye, Monilola A. (Prof. Dr.)Epidermal growth factor receptor (EGFR)-targeted cancer treatments with antibodies like Cetuximab are successfully used in the clinic for about 20 years. However, intrinsic, as well as newly developed resistance mechanisms to EGFR-targeted therapies, are the main reason for their failure. Activation of human epidermal growth factor receptor 3 (HER3)-signaling upon EGFR-targeted therapies is frequently observed and has motivated the development of combination therapies that simultaneously block EGFR and HER3. In this study, bispecific and bivalent, or tetravalent, respectively, single-chain diabody (scDb) and scDb-Fc molecules were developed comprising the antigen-binding sites of a humanized version of Cetuximab (hu225) as well as a recently developed anti-HER3 antibody (3-43). In total, eight molecules (two scDb and six scDb-Fc) with varying linkers were engineered. The scDb hu225x3 43 Fc showed the most favorable properties regarding production yield, purity, homogeneity and linker setup. Binding of the scDb-Fc to recombinant receptors, as well as to HER-family receptor expressing cell lines revealed retained binding properties, compared to parental antibodies. Furthermore, the scDb hu225x3 43 Fc showed strong and long-lasting inhibition of downstream signaling by EGF, HRG or combination of both ligands. Proliferation studies on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), triple negative breast cancer (TNBC), and colorectal cancer (CRC) cell lines revealed either similar, or stronger inhibition, compared to parental antibodies as single or combination treatment, which translated into to long-lasting growth suppression in a s.c. xenograft tumor model. Treatment with the bispecific antibody inhibited in vitro HRG-stimulated oncosphere formation of two TNBC cell lines. In an orthotopic MDA-MB-468 tumor model, superior antitumor effects were observed compared to those obtained by the parental antibodies alone or in combination. Furthermore, this was associated with a reduced number of cells with stem-like properties demonstrating that the bispecific antibody not only efficiently blocks TNBC proliferation but also the survival and expansion of the cancer stem cell population. The high degree of plasticity and compensatory signaling within the HER-family not only leads to compensatory crosstalk by HER3 but also HER2 giving the rational to combine the EGFR- and HER3-targeting scDb-Fc with a HER2-targeting antibody like Trastuzumab. The triple-targeting approach with the scDb-Fc and Trastuzumab was superior in inhibition of HRG-stimulated proliferation of the CRC cell line LIM1215 compared to the combination of IgG hu225, Trastuzumab and IgG 3 43. This was also observed in primary and secondary CRC oncosphere formation assays. Finally, in CRC patient derived organoids (PDOs) grown in HRG-supplemented medium the triple-targeting of EGFR, HER2 and HER3 provided broader efficacy than dual- or mono-targeting of receptors of the HER family. In contrast to Afatinib (anti-EGFR, -HER2, -HER4), the triple-targeted antibody approach showed efficient inhibition in all tested PDOs. Thus, the bispecific scDb-Fc alone or in combination with Trastuzumab represents a superior strategy to deal with primary and acquired resistances compared to targeting a single receptor with different antibodies or any combination of antibodies targeting two receptors of the HER-family.Item Open Access Enzymatische Hydratisierung kurzkettiger Fettsäuren und Alkene(2018) Demming, Rebecca M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)