Universität Stuttgart

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Publication Type: search.filters.UBSTyp.DissertationStart date: 2021End date: 2021Institute: search.filters.UBSInstitut.Institut für Biochemie und Technische Biochemie

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    Mechanistic studies on the DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B
    (2021) Dukatz, Michael; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)
    In this work, both regulatory and catalytic mechanisms of de novo methyltransferases were investigated, which include interactions with other proteins and the specific recognition of the substrate sequence. Another part of this work strived to elucidate how enzymatic generation of 3-methylcytosine by DNMT3A can occur.
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    EPIC’RISPR: a modular and inducible platform for highly parallel synthetic epigenetics and chromatin imaging in a high-throughput format
    (2021) Oberacker, Phil; Jurkowski, Tomasz P. (Dr.)
    The epigenome describes the sum of epigenetic states in an organism. It consists of biochemical modifications of the DNA and histone proteins, non-coding RNAs and the three-dimensional architecture of the genome. These modifications and structures regulate the genome expression in a cell-type-specific pattern and hence control the development of the whole organism. Research in this field yielded a lot of descriptive information about the correlation between epigenetic marks and gene expression. Unfortunately, we do not know much about the causalities within the epigenetic network. With the discovery of the groundbreaking CRISPR/Cas9 technology, it is now possible to interfere with the epigenetic program. This methodology, which is known as epigenetic editing, allows the recruitment of effector molecules to distinct targets where they introduce or remove specific modifications. By observing the response of the epigenome, we can conclude how the epigenetic network functions. However, this system is somewhat limited regarding the simultaneous modification of multiple loci, which is a necessity for investigating a network. In this thesis, I combined the targeting and recruiting functionality of the CRISPR/Cas9 system in one molecule, the gRNA. Like this, this EPIC’RISPR platform can recruit numerous effector molecules to one or multiple targets simultaneously without interference. I demonstrated this by activating and repressing three target genes with different effector domains at once and by recruiting different fluorophores to several target loci. I further applied this technology to perturb five differently expressed target genes simultaneously with one effector molecule at a time. For this, I performed a large-scale experiment in which I probed the effects of more than 60 epigenetic effector molecules on target gene transcription. I identified several promising candidates which might exhibit synergistic behaviour and hence a stronger and longer-lasting impact on the epigenetic program. Furthermore, I developed ON- and OFF-switches for the EPIC’RISPR system which utilize small molecules to fine-tune the introduced effects arbitrarily. The OFF-switch was further applied for transgene expression control, extending the functionality of this system even further. Additionally, our group developed protocols for the synthesis and functionalisation of paramagnetic beads and their application in the automated high-throughput extraction of nucleic acids. Since its publication, our platform, which we call Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) has since become a hub for collaborations in open-source science, especially during the COVID-19 pandemic.
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    Enzymkatalysierte regioselektive N-Methylierung und N-Alkylierung von Pyrazolen
    (2021) Bengel, Ludwig L.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
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    Peptide und Fusionsproteine für die Biomineralisation von Hydroxylapatit
    (2021) Henkes, Thorsten Matthias; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
    Mittels des sogenannten Phagen Display wurden Peptide identifiziert, welche an Hydroxylapatit binden. Diese Bindemotive wurden in oberflächenaktive Fusionsproteine integriert. Die Bindung der Phagen-präsentierten Peptide, von synthetischen Peptiden und der Fusionsproteine an Hydroxylapatit sowie der Einfluss von Peptiden und Fusionsproteinen auf die Nukleation von Hydroxylapatit wurden untersucht. Ebenso wurden gebildete Präzipitate mittels SEM EDX und TEM charakterisiert. Auf diese Weise wurden Peptidmotive und Fusionsproteine identifiziert, welche die Nukleation von Hydroxylapatit beschleunigen oder verlangsamen können.
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    Loop-Modifikationen als Engineering Strategie zur Optimierung der Cumol Dioxygenase
    (2021) Heinemann, Peter M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
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    Studies of the toluene dioxygenase from Pseudomonas putida F1: influence of active-site positions on hydroxylations of mono- and bicyclic aromatics
    (2021) Wissner, Julian L.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
    Till today, the selective dearomatizing cis-dihydroxylation of aromatics cannot be performed chemically. Hence, it is truly exceptional how nature evolved Rieske non-heme iron dioxygenases (ROs), capable of performing such challenging reactions. These enzymatic multicomponent systems are not only able to catalyze cis-dihydroxylation reactions with outstanding activity, but also with an excellent enantioselectivity (>99% ee) for a broad range of aromatic substrates. In their natural host, ROs are involved in the initial catabolism of aromatic compounds into intermediates of the tricarboxylic acids cycle. In biocatalysis, the oxyfunctionalizing capabilities of ROs can be utilized to synthetize cis-dihydrodiols from mono- and polycyclic arenes. These hydroxylated compounds are valuable synthons, frequently employed in the synthesis of natural products, pharmaceuticals, and fine chemicals. One of the best experimentally characterized ROs reported in literature is toluene dioxygenase (TDO), from Pseudomonas putida F1, which substrate scope comprises over 100 different compounds. Nevertheless, a restraint hampering TDO application as a biocatalyst for the targeted cis-dihydroxylation of aromatics, is the observed decrease in conversion as substrate size increases, resulting in modest product yields. Therefore, fundamental studies revealing the influence of TDO active-site positions, enabling a better conversion of mono- and especially bulky bicyclic aromatics are compulsory. Such need prompted the present thesis, which focused on TDO as model biocatalysts, since it displays remarkable substrate promiscuity and advantageous features for preparative biotransformations. The central task of this work was fostering the biocatalytic capabilities of TDO toward the cis-dihydroxylation of four aromatic model substrates. The first step was the development of an enhanced recombinant TDO system in Escherichia coli (E. coli), for an efficient dioxygenase overexpression. Therefore, the new platform E. coli BW25113 pBAD18-TDO was established, which exhibited outstanding product formation for the bicyclic substrate naphthalene. Nevertheless, in the attempt to apply such platform for the conversion of small monocyclic aromatics, an unforeseen downstream reaction catalyzed by E. coli, dehydrogenating the generated cis-dihydrocatechols to the corresponding catechols, was discovered. By performing a systematic screening of dehydrogenase deficient single knock-out strains from the KEIO collection, the enzyme glycerol dehydrogenase (GldA) from E. coli was identified as the main responsible for such degradation. These findings drove the development of the enhanced platform E. coli BW25113 ΔgldA pBAD18-TDO, allowing the abolishment of the unwanted secondary reaction. Thus, a semi-preparative biotransformation of benzene was performed utilizing the customized TDO platform, resulting in the isolation of 141 mg (31%) of cis-dihydrocatechol as sole product. The system was also tested for the semi-preparative biotransformation of the bicyclic substrate naphthalene, yielding 287 mg (89%) of enantiopure (1R,2S)-1,2-dihydro-1,2-naphthalenediol. Once the TDO platform was established and successfully applied, the next task was to explore the influence of TDO active-site position F366 in naphthalene conversion by generating and investigating a set of nine TDO variants at this position. Strikingly, the single point variant TDOF366V revealed that the enantioselectivity could be switched completely. Furthermore, semi-preparative naphthalene biotransformations with TDOF366V enabled the synthesis of 101 mg (31%) enantioenriched (1S,2R)-1,2-dihydro-1,2-naphthalenediol (90% ee). It is worth to mention that before this study, this enantiomer was never directly generated either chemically or biocatalytically. The next aim was to expand the TDO-based biocatalyst portfolio by generating a semi-rational designed TDO single- and double mutant library. Thus, the library consisting out of 176 variants was tested for the conversion of the bicyclic substrates naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydroquinoline, and 2-phenylpyridine in the pursue to enhance product formation and/or chemo-, regio- and enantioselectivity. These studies highlighted that introduced mutations at the active site hot-spot positions M220, A223 and F366, strongly influences chemo-, regio- and enantioselectivity. Moreover, mutations at positions M220 and A223 also exerted substantial effects on product formation during the conversion of bicyclic (hetero)aromatics. In addition, since the TDO mutant library addressed all 14 non-conserved active site amino acids, it was noticeable that the active site is highly tolerant to the introduction of mutations. Additionally, it could be assessed that the combination of the outperforming mutations into the double variant TDOF114H_A223T entirely abolished the formation of the side product quinoline in 1,2,3,4-tetrahydroquinoline biotransformations. This approach enabled in a semi-preparative biotransformation the selective production of 106 mg (71%) of enantioenriched (R)-1,2,3,4-tetrahydroquinoline-4-ol (94% ee). Further, double variant TDOM220A_V309G exhibited an astonishing 15.1-fold higher conversion of the substrate 2-phenyl-pyridine, in comparison to TDO wild type. This enhancement enabled for the first time, the TDO-catalyzed production of 114 mg (60%) enantiopure (1S,2R)-3-(pyridin-2-yl)cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol, along with reduced amounts of 6 mg (4%) 2-phenylpyridin-3-ol, as side product. These compelling findings meet the scope of this thesis, in terms of fostering TDO product formation as well as chemo-, regio- and enantioselectivity for bulky bicyclic (hetero) aromatics. Hence, this dissertation highlights the importance of both, the improvement of the recombinant E. coli BW25113 platform, as well as the enhancement of the biocatalyst TDO via enzyme engineering for the generation of valuable cis-dihydroxylated compounds.
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    Engineering von Enzymtunneln : experimentelle Studie, in silico Modellierung und Simulation der Monooxygenase CYP153AM.aq
    (2021) Rapp, Lea R.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)
    Enzyme werden heutzutage als flexible und hochdynamische Makromoleküle und nicht mehr als statische Strukturen betrachtet. Daher ist das klassische Schlüssel-Schloss-Modell, das 1894 von Emil Fischer postuliert wurde, mittlerweile überholt. In neueren Betrachtungen wird die Flexibilität und auch die von Liganden induzierte Dynamik der Enzyme zusätzlich berücksichtigt. Es wurde gezeigt, dass gezielte Veränderungen der flexiblen Elemente von Enzymen die dominanten Konformationen des Proteins beeinflussen, was mitunter für eine effizientere Katalyse von Vorteil sein kann. Jedoch ist der Einfluss von gezielten Veränderungen durch Mutationen der dynamischen Bereiche, besonders von Enzymtunneln, aufgrund der geringen Konservierung von Aminosäuren meist schwierig vorherzusagen und rationale Ansätze aus diesem Grund bisher eine Seltenheit. Zur Vereinfachung wird daher immer noch oftmals mit den statischen Kristallstrukturen von Proteinen für das (semi-)rationale Enzym Engineering gearbeitet. Hinzu kommt, dass viele Enzyme ihr katalytisches Zentrum nicht nahe der Oberfläche ungeschützt präsentieren, sondern tief in der Proteinstruktur verbergen, um unspezifische katalytische Reaktionen auszuschließen und das aktive Zentrum zu schützen. In diesem Fall wird das „Schlüsselloch“ dem alten Modell hinzugefügt, das den Zugang des „Schlüssels“ zum „Schloss“ reguliert. Frühere (semi-)rationale Engineering Ansätze fokussierten sich hauptsächlich auf die aktive Tasche oder deren beeinflussende Aminosäuren in einer bestimmten Nähe zum katalytischen Zentrum oder des kristallisierten Liganden. Immer mehr an Interesse gewinnt innerhalb der Biokatalyse jedoch die Erforschung und Veränderung von weiter entfernten hochflexiblen Strukturelementen wie Loopregionen und molekulare Tunnel anstelle des aktiven Zentrums. Aktuelle Forschungen an Oberflächenloops zeigen, dass diese flexiblen Loopregionen zum Teil den Eingang wichtiger Substrattunnel bestimmen. Daher wurde im Zuge dieser Dissertation das Potenzial des Tunnel Engineerings am Beispiel der P450 Monooxygenase CYP153AM.aq aus dem Organismus Marinobacter aquaeolei VT8 untersucht. Das Prinzip des Tunnel Engineerings zur Verbesserung oder Umsetzung neuer enzymatischer Funktionen ist anerkannt, wird aber experimentell noch sehr wenig genutzt, obwohl prognostische Simulationen und retrospektive Aufklärungen existieren. Zu Beginn dieser Arbeit wurde das CYP153AM.aq System im Hinblick auf die in der Kristallstruktur vorhandenen Tunnel untersucht und eine erweiterte Analyse mit dem in silico Werkzeug CAVER durchgeführt. Dabei wurden drei Enzymtunnel identifiziert: Zwei putative Substrattunnel 2c und 2e und ein Solvent Tunnel S. In einer anfänglichen Mutagenesestudie wurden die Tunnel separat durch einzelne Substitutionen der strukturbildenden Aminosäuren hinsichtlich der Umsetzung verschiedener Substrate untersucht. Basierend auf den vorherigen Studien des Enzyms wurden diese Varianten auf die Spezifität hinsichtlich Fettsäuren mit unterschiedlichen Kettenlängen (C8, C12 und C16) evaluiert. Da für diese Arbeit unter Anderem kürzerkettige Moleküle (C8) von Interesse waren, wurden aus der Klasse der Alkane n-Octan und zusätzlich das Alken trans-2-Octen getestet. Die Ergebnisse demonstrieren, dass Mutationen in den Tunneln 2c und 2e die Umsetzung und die Spezifität hinsichtlich verschiedener Substrate beeinflussen. Drei Positionen stachen dabei besonders hervor: M228 zeigte je nach Mutation Einfluss auf den Substratumsatz in Abhängigkeit von der Kettenlänge der Substrate, Q129 und V141 beeinflussten vor allem die Umsetzung kürzerkettiger Substrate. Werden diese Aminosäurereste in der Kristallstruktur betrachtet, fällt auf, dass sie ein Dreieck um den Tunnel 2c bilden und teilweise den Tunnel 2e begrenzen. Für die nachfolgende Mutagenesestudie an den oben genannten Aminosäuren wurde die Octansäure als Zielsubstrat gewählt. Besagte Reste wurden mittels Sättigungsmutagenese verändert und eine Variantenbibliothek erstellt. Um Varianten mit verändertem Produktspektrum zu identifizieren, wurde ein P450-Ganzzell-Screening auf Basis der indirekten Produktdetektion mittels Wasserstoffperoxid / HRP-vermittelter Oxidation des Farbstoffs ABTS angepasst. Mit drei unterschiedlichen semi-rationalen Mutagenese Ansätzen, die auf Struktur-Sequenz-Alignments der 3DM-Datenbank und Kristallstrukturen von CYP153AM.aq und dem homologen CYP153AP.sp basieren, wurden moderate Auswirkungen auf die Produktbildung erzielt. Durch die anschließende Kombination der besten Hits konnte eine Zweifach- (M.aqRT) und schließlich eine Dreifachvariante (M.aqRLT) generiert werden, die die effiziente ω-Hydroxylierung von Octansäure ermöglichen. M.aqRLT zeigte eine 151-fach verbesserte katalytische Effizienz und eine stark erhöhte Substratbindung (25-fach verringerter Km im Vergleich zum Wildtyp). Mithilfe von molekulardynamischen Simulationen konnten neue Erkenntnisse über die Dynamik des Enzyms gewonnen und aus den Mutationen resultierende Modifikationen der Tunnelstruktur verdeutlicht werden. Eine stark reduzierte Flexibilität und ein neuer Bottleneck des Tunnels 2c stellten sich als Hauptmerkmale der generierten Varianten heraus, die für die Stabilisierung des Enzym-Substrat-Komplexes und die Steigerung der katalytischen Effizienz verantwortlich sind. Die Interaktion des von S. Hoffmann beschriebenen Arginins als Fettsäureanker, Q129R, mit dem Carboxylat der Octansäure führt zu deren Stabilisierung in der reaktiven Konformation, wodurch die Aktivität der Variante M.aqRLT gegenüber Octansäure stark gesteigert wird. Durch die Generierung eines artifiziellen Fusionskonstrukts M.aqRLT-PFOR und der in vivo Vorausschaltung einer Thioesterase, die vermehrt Octansäure bildet, wurde die de novo Produktion von 129 ± 5 µM ω-Hydroxyoctansäure als Anwendungsbeispiel gezeigt. Im finalen Teil der Arbeit wurde durch gezieltes Engineering innerhalb der Tunnel die Substratpräferenz von CYP153AM.aq zu Dodecylamin, einem inhibierend wirkenden Fettamin, verändert. Um die Variantenbibliothek direkt aus 96-Deepwell Platten zu messen, wurde eine auf LC/MS-basierende Screeningmethode etabliert und angewendet. Durch die Umgehung einer chromatographischen Trennung der Analyten konnte die Messzeit erheblich, von 5,5 Minuten auf 36 Sekunden je Probe herabgesetzt werden. Während das verwendete Dodecylamin auf den Wildtypen als Inhibitor wirkt (IC50 = 0,9 µM) konnte durch gezielte Mutagenese an den in dieser Arbeit identifizierten Hotspots eine Variante, M.aqESE, generiert werden, die den bisherigen Inhibitor als ein neues Substrat akzeptiert (10 TON h-1). Durch das Einbringen von zwei Glutaminsäuren wurde die Aminogruppe im Tunnel fixiert und daran gehindert an das katalytisch aktive Eisen zu koordinieren, was den inhibierenden Effekt auslöst. Es zeigte sich, dass die generierten Varianten weniger durch das Amin gehemmt werden und gleichzeitig weniger affin zur Säure sind, da die Säuregruppe von den Glutaminsäureresten abgestoßen wurde. Im Verlauf dieser Arbeit konnte deutlich gezeigt werden, welche enormen Effekte durch Enzym Engineering an Tunnelstrukturen generiert werden können und welches Potenzial in der Kombination von experimentellen Versuchen und der computergestützten Modellierung und Simulation zum tiefergehenden Verständnis von Enzymen und Enzymkatalyse liegt.