Universität Stuttgart
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Item Open Access Resolving heterogeneities in single and multiphase bioreactor systems - Predictive modelling tools towards successful scale-up(2020) Kuschel, Maike; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Data integration and data mining for the exploration of enzymatic sequence-structure-function relationships(2018) Buchholz, Patrick C. F.; Pleiss, Jürgen (Prof. Dr.)Item Open Access Enzymatische Hydratisierung kurzkettiger Fettsäuren und Alkene(2018) Demming, Rebecca M.; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)Item Open Access Numerische Simulationen von bioinspirierten und natürlichen Materialien(2021) Schäfer, Immanuel; Schmauder, Siegfried (Prof. Dr. rer. nat. Dr. h. c.)Die Arbeit befasst sich mit Finite-Elemente-Simulationen und Modellierungen von natürlichen und bioinspirierten Materialien. Die bioinspirierten Materialien sind künstliche Materialien, die ein oder mehrere Prinzipien der biologischen Vorbilder erfolgreich umgesetzt haben. Die natürlichen Materialien sind biologischen Ursprungs. Zu Beginn benötigt man immer eine funktionelle Analyse des Systems, um dann die notwendigen Reduzierungen für die Modellierungen herstellen zu können. Wenn das Modell steht, werden Eigenschaften wie zum Beispiel die Dämpfung oder der Widerstand gegen eine lineare Krafteinwirkung in Finite-Elemente-Simulationen analysiert. Die daraus gewonnenen Ergebnisse werden zur Beurteilung des Versagenverhaltens (z. B. des natürlichen Materials) oder zur Erklärung der Eigenschaften des bioinspirierten Materials genutzt. Die vorliegende Arbeit ist in die Analyse und die Diskussion der Ergebnisse verschiedener Materialien in neun Veröffentlichungen unterteilt. Zu Beginn werden die Ergebnisse des ersten bionischen Projektes präsentiert sowie die Lichtaufnahme, Lichtleitung- und Lichtverarbeitungsmöglichkeiten einer sukkulenten Art, der Fensterpflanze diskutiert. Die Perlmuttschale einer Schnecke bzw. ihr bioinspiriertes Produkt ist das Thema der anschließend vorgestellten Arbeiten. Daraus hervor ging auch die Veröffentlichung zu Enzymen und deren Bindungsaffinitäten zu Zinkoxid. Die Schale der Pomelo, die die kiloschwere Frucht beim Herunterfallen von den ca. 15 m hohen Bäumen vor Beschädigungen schützt, ist das Vorbild für einen Metallschaum im nächsten Beispiel. Als letztes werden die Vorbilder Kokosnuss und Seeigelstachel präsentiert, die im Rahmen eines Transregios (einem von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Sonderforschungsbereich, TRR 141) betrachtet wurden. Für den TRR 141 wurde auch eine Ausstellung im Naturkundemuseum Stuttgart organisiert. Im Kapitel 12 wird eine Präsentationsstation beschrieben, die mit NFC(Near-Field-Communication)-Chips gesteuert werden kann. Die Präsentationsstation wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt und mit dem Museum zusammen gebaut. Mit ihr werden Filme und Präsentationen zu dem Thema des TRR mit Ausstellungsgegenständen (z. B. eine 3D gedruckte Struktur des Seeigelstachels in Vergrößerung) kombiniert. Auf diese Weise zeigt die vorliegende kumulative Dissertation einen Überblick über die gesamten bionischen Arbeiten, die am Institut für Materialprüfung, Werkstoffkunde und Festigkeitslehre bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Dr. h. c. Siegfried Schmauder mit meiner Beteiligung entstanden sind.Item Open Access Subzelluläre Metabolit-Analyse in Säugerzellen : Methodenentwicklung und Anwendung zur Untersuchung des Stoffwechsels von CHO-Zellen(2017) Matuszczyk, Jens-Christoph; Takors, Ralf (Prof. Dr.-Ing.)Item Open Access Entwicklung von Verfahren zur enzymatischen Epoxidierung von Pflanzenölen und Fettsäurederivaten(2018) Haitz, Fabian; Hirth, Thomas (Prof. Dr. rer. nat.)Pflanzliche Öle werden in der chemischen Industrie häufig funktionalisiert, um in verschiedenen Anwendungsgebieten eingesetzt werden zu können. Eine interessante Funktionalisierung stellt die Epoxidierung der in verschiedenen Fettsäuren enthaltenen C=C-Doppelbindung dar. Die so erzeugten Pflanzenöl-basierten Epoxide können beispielsweise als Weichmacher in Kunststoffen, als Monomerbausteine zur Herstellung von Polymeren oder als Intermediate zur Herstellung von Schmierstoffen verwendet werden. Zur Epoxidierung von Pflanzenölen und daraus gewinnbaren Fettsäurederivaten können Enzyme eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 18 verschiedene freie Lipasen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Persäurebildung untersucht und die damit verbundene Epoxidierung am Beispiel von Ölsäure für neun ausgewählte Lipasen gezeigt. Dabei wurden fünf neue CalB-ähnliche Lipasen aus verschiedenen Pseudozyma sp. identifiziert und auf Aminosäureebene mit der Lipase B aus Pseudozyma antarctica (CalB) verglichen. Die Epoxidierung verschiedener Pflanzenöle und Pflanzenöl-basierter Derivate wurde unter Verwendung einer immobilisierten Lipase optimiert. Die Optimierung der enzymatischen Epoxidierung zweier nicht im Lebensmittelbereich eingesetzter Pflanzenöle, Drachenkopf- und Senföl, erfolgte mit Hilfe der statistischen Versuchsplanung. Als Einflussgrößen wurden die Enzym- und Lösemittelmenge, die Inkubationszeit und die Reaktionstemperatur variiert. Durch die Auswahl dieser beiden hinsichtlich ihrer Fettsäurezusammensetzung sehr unterschiedlichen Pflanzenöle konnte eine Prozessoptimierung unter Berücksichtigung der Substratcharakteristika erfolgen. Dabei wurden für beide Öle Epoxidausbeuten von über 90 % erzielt. Die in dieser Arbeit für zwei verschiedene Pflanzenöle optimierten Reaktionsparameter konnten erfolgreich auf die Umsetzung von 15 verschiedenen Pflanzenölen übertragen werden. Für alle Öle wurden Epoxidausbeuten von 70 bis über 95 % erreicht. Die unterschiedlichen enzymatisch hergestellten Pflanzenölepoxide wurden umfangreich hinsichtlich der Viskosität sowie des Schmelz- und Kristallisationsverhaltens charakterisiert. Dabei wurden die Ergebnisse erstmals in Bezug auf die Fettsäurezusammensetzung der Substrate diskutiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit erfolgreich die Epoxidierung verschiedener Fettsäurederivate gezeigt. Dabei wurden Fettsäuremethylester, verschiedene freie Fettsäuren, 9-Octadecen-1,18-dicarbonsäure und 9-Octadecen mit hohen Epoxidausbeuten umgesetzt. Die Skalierbarkeit der chemo-enzymatischen Epoxidierung wurde in dieser Arbeit erfolgreich am Beispiel der Umsetzung von Drachenkopföl bis in den 10 L-Maßstab gezeigt. Als geeignetes Maßstabsübertragungskriterium wurde der konstante volumenspezifische Leistungseintrag identifiziert. Im Zuge der Maßstabsübertragung wurde außerdem der Einfluss verschiedener Prozessparameter, wie des Lösemittel- und Dispersphasenanteils sowie der Rührerdrehzahl auf die im Reaktor erzielte Tropfengrößenverteilung beschrieben. Zur in-situ-Messung der Tropfengrößenverteilung wurde ein 3D-ORM-System eingesetzt. Die sich bei spezifischen Prozessbedingungen einstellende charakteristische Tropfengrößenverteilung wurde in Form des sogenannten Sauterdurchmessers d32 dargestellt und anschließend in Zusammenhang mit den jeweils erzielten Epoxidierungsraten diskutiert.Item Open Access TAL1 und miR-17-92 bilden eine regulatorische Schleife in der Hämatopoese(2020) Meyer, Annekarin; Lausen, Jörn (Prof. Dr.)Item Open Access Development of artificial single and double reading domains to analyze chromatin modification patterns(2018) Mauser, Rebekka; Jeltsch, Albert (Prof. Dr.)The unstructured N-terminal tails of histone proteins carry many different post-translational modifications (PTMs), like methylation, acetylation or phosphorylation. These PTMs can alter the chromatin structure, influence the interaction of adjacent nucleosomes and serve as specific binding sites for histone interacting domains. Currently, the investigation of histone tail PTMs is mainly based on antibodies, however concerns about the specificity of these antibodies and reproducibility of data arouse. Therefore, it was one aim of this thesis to develop alternative approaches to histone tail PTM antibodies. Previous studies already showed that histone modification interacting domains (HiMIDs) can replace histone tail antibodies in a highly effective manner. As part of this work, the TAF3 PHD domain was established as new H3K4me3 specific HiMID. In peptide array binding and Far-western blot assays, the domain showed a specific interaction with H3K4me3 modifications. Also in ChIP like experiments (CIDOP: Chromatin Interacting Domain Precipitation) coupled to qPCR and next generation sequencing, the domain showed a similar performance as validated H3K4me3 antibodies. With the proposal of the histone code hypothesis the question was raised if combinations of histone modifications carry specific biological functions. However, so far, the experimental analysis of the co-occurrence of histone modification on the same nucleosome in a genome-wide manner is a challenging task. For this reason, the main aim of this work was to develop double reading domains in which two histone reading domains are fused together with a flexible linker to achieve simultaneously readout of dual histone tail modifications in a single CIDOP experiment. To validate the concept, the Dnmt3a PWWP domain and the MPP8 Chromo domain were fused together and their specific recognitions of H3K36me2/3 and H3K9me3 histone tail modifications were analyzed. Biochemical investigations like peptide arrays, Far-western blot and western blot experiments showed that both domains specifically interact with their targets and preferentially interact with double modified chromatin. Additionally, the preferred interaction with double modified chromatin could be further verified with binding pocket mutants and methyl-lysine analogues. The newly generated double domain was used in chromatin precipitation experiments to identify genome regions where both modifications are present. The genome-wide distribution of the H3K36me2/3-H3K9me3 showed that this combination of histone marks represents a novel bivalent chromatin state, which is associated with weakly transcribed genes and is enriched for binding sites of ZNF274 and SetDB1. Also in this work, mixed peptide arrays were introduced as new screening method for the efficient analysis of double reading domains. The naturally occurring double reading domain of the BPTF protein was used to demonstrate the capability of this new screening tool. BPTF contains a PHD domain, which binds to H3K4me3 and a Bromo domain, which interacts with acetyl groups of the H4 tail. Synergistic binding to both peptides was shown using the newly developed mixed peptide arrays. Additionally, in the course of this work mixed peptide arrays were used to optimize several of the designed double reading domains. Furthermore, some other double reading domains were generated in this work, like PWWP-ATRX, MPP8 Chromo domain-L-double Tudor and CBX7 Chromo domain-L-MPP8 Chromo domain and analyzed for specific dual readout. Also double reading domains with dual specificity for DNA methylation and histone marks were generated. The firstly used methyl-DNA binding domain of the MBD2 protein showed a strong binding, dominating the effect of the HiMIDs. Therefore, the weaker but still specific methyl-DNA binding domain of the MBD1 protein was used. First experiments with this new fusion constructs showed a simultaneously interaction with chromatin which is associated with DNA methylation and histone PTMs. In summary, the studies with double reading domains showed that with this novel method precipitation of double modified chromatin is possible and that the genome-wide investigation of newly studied bivalent chromatin states is feasible. Therefore, this novel approach makes it possible to analyze many different combinations of histone modifications, investigate their influence on chromatin and gain a deeper understanding of the biological role behind histone tail modification patterns.Item Open Access Enzymatic asymmetric dihydroxylation of alkenes(2016) Gally, Christine; Hauer, Bernhard (Prof. Dr.)The introduction of chirality into C=C double bonds is of special interest in organic synthesis. In particular, the catalytic asymmetric dihydroxylation (AD) of alkenes has attracted considerable attention due to the facile transformation of the chiral diol products into valuable derivatives. By chemical means, the metal-catalyzed AD of olefins provides both stereo- and regiospecific cis-diol moieties. Next to their toxicity, however, these metal catalysts can also lead to byproduct formation as a result of oxidative fission. In nature, Rieske non-heme iron oxygenases (ROs) represent promising biocatalysts for this reaction since they are the only enzymes known to catalyze the stereoselective formation of vicinal cis-diols in one step. ROs are key enzymes in the degradation of aromatic hydrocarbons and can target a wide variety of different arenes. Despite their broad substrate scope, limited data is available for the conversion of unnatural substrates by this class of enzymes. To explore their potential for alkene oxidation, three ROs were tested for the oxyfunctionalization of a set of structurally diverse olefins including linear and cyclic arene-substituted alkenes, cycloalkenes as well as several terpenes. Naphthalene- (NDO), benzene- (BDO) and cumene dioxygenases (CDO) from different Pseudomonas strains where selected as they are amongst the RO enzymes that have already been reported to catalyze the oxidation of a small number of olefins. The majority of compounds from the selected substrate panel could be converted by NDO, BDO or CDO and products were either isolated and identified by NMR analysis or using the authentic standards. Dependent on the substrate, allylic monohydroxylation was found in addition to the corresponding diol products, a reaction which is chemically still most reliably achieved by the use of SeO2 in stoichiometric amounts. However, having been evolved for the dihydroxylation of aromatic compounds, wild type ROs displayed low conversions (< 50%) and modest stereoselectivities (≤ 80% ee/de) for several of the tested olefins. To overcome these limitations, changes in the active site topology of RO catalysts were introduced. A single targeted point mutation that was identified based on sequence and structural comparisons with other members of the RO family proved to be sufficient to generate BDO and CDO variants displaying remarkable changes in regio- and stereoselectivity for various substrates. In particular biotransformations with CDO M232A gave excellent stereoselectivities (≥ 95% ee/de) and good activities (> 90%) also for linear alkenes, which have been reported to be challenging substrates for RO-catalyzed oxyfunctionalizations. Site-saturation mutagenesis at position 232 in CDO revealed a correlation between the steric demand of the amino acid side chain and its influence on regio- and/ or stereoselectivities for styrene and indene. While the wild type enzyme almost exclusively catalyzed the dihydroxylation of the aromatic ring, the regioselectivity was shifted with decreasing side chain size to the terminal vinyl group of styrene, yielding up to 96% of the alkene-1,2-diol. For cis-1,2-indandiol formation, enantiocomplementary enzymes could be generated, a fact further highlighting the importance of position 232 for the engineering of ROs. Moreover, site-saturation mutagenesis of additional residues in the substrate binding pocket of CDO (F278, I288, I336 and F378) identified further positions having an influence on selectivity and product formation for alkene oxidation. To proof the applicability of ROs for organic synthesis, semi-preparative scale biotransformations (70 mg) of selected substrates were performed with CDO M232A. Without further optimization of the reaction set-up, products were successfully isolated in > 30% yield. In addition, up-scaling of (R)-limonene hydroxylation to 4 L in a bioreactor with growing cells gave final isolated product titers of 0.4 g L-1 even though substrate volatility and product toxicity diminished the yield. In conclusion, these examples demonstrated that a single point mutation was sufficient to transform CDO wild type into an efficient catalyst, furthermore constituting the first example of the rational engineering of CDO and BDO enzymes for the oxyfunctionalization of a broad range of alkenes.Item Open Access Lokalisation, Speicherung und Synthese von Polyphosphat in Agrobacterium tumefaciens C58(2021) Hellenbroich, Celina; Jendrossek, Dieter (apl. Prof. Dr. rer. nat.)Polyphosphat (PolyP) besitzt eine ubiquitäre Verbreitung und erfüllt, je nach Organismus, unterschiedliche und extrem vielfältige Aufgaben. In Prokaryonten liegt PolyP in sogenannten Granula vor, während in einzelligen Eukaryonten, eine Membran das PolyP von dem Cytoplasma abtrennt. Vorangegangene Arbeiten weisen darauf hin, dass sogenannte Acidocalcisomen, eben jene membranumschlossene PolyP-Speicher aus Eukaryonten, auch in dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens vorhanden sein könnten. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass sich in A. tumefaciens, wie in Bakterien übliche, PolyP-Granula befinden, die nicht von einer Membran umschlossen sind. Im weiteren Verlauf wurde die Synthese von PolyP sowie die Lokalisation der Polyphosphatkinasen (PPKs) und anderer aus der Literatur bekannter, PolyP-assoziierter Proteine untersucht. Die PPK1At stellte sich hierbei als PolyP-Syntheseenzym heraus. Es folgte eine biochemische Charakterisierung der PPKs in vitro, bei der für die PPK2At, neben der Bildung von NDP und NTP, eine oligophosphorylierende Funktion bis hin zu nonaphosphorylierten Nukleosiden entdeckt wurde. Außerdem stellte sich heraus, dass das PolyP-Granulum während des Zellzyklus wanderte und vielleicht durch die PPK1At mit der DNA assoziiert sein könnte. Aufgrund dieser Erkenntnisse konnte ein Modell des PolyP-Granulums und den in dieser Arbeit identifizierten, assoziierten Proteinen erstellt werden. Eine Deletion der ppk1 hatte zudem Auswirkungen auf die Zellmorphologie, die Infektionsrate von Pflanzenzellen und die Generationszeit von A. tumefaciens.